Введение к работе
Пептиды представляют собой уникальную группу природных биорегуляторов, образующихся в тканях человека и животных. Соединения этого типа отличаются высокой специфичностью, способностью функционировать в очень низких концентрациях, многообразием биологических эффектов.
В то же время многофункциональность пептидов, кратковременность действия, сложность структуры являются серьезным препятствием к их практическому применению. Актуатьной задачей является изучение механизмов действия пептидов, причем центральное место занимают вопросы исследования принципов передачи информации этими соединениями.
Современное понимание процессов действия пептидных биорегуляторов показывает, что, наряду с самими пептидами, самостоятельной биологической активностью обладают их фрагменты, образующиеся в процессе ферментативной деградации.
Однако на сегодняшний день возможность образования различных фрагментов пептидных биорегуляторов изучена недостаточно:
не существует методов, позволяющих наблюдать поэтапность расщепляющих процессов, приводящих к полной деградации пептидных молекул под действием ферментов;
не проводились исследования по выявлению возможных путей деградации пептидных биорегуляторов, что, несомненно, важно для понимания интегральных эффектов природных пептидов;
не проводились исследования по выявлению различных фрагментов пептидных биорегуляторов, которые могут присутствовать в биологической жидкости в результате процесса деградации пептидов под действием ферментов, что позволило бы анализировать эти фрагменты как в смеси, так и по отдельности.
В настоящее время ведется поиск модифицированных аналогов пептидных биорегуляторов, обладающих селективным действием, устойчивостью к энзиматической деградации (пролонгированное действие). Актуальной задачей является изучение возможности получения новых аналогов на основе фрагментов, образующихся в результате деградации пептидного биорегулятора под действием ферментов.
Рассмотрение указанных выше аспектов действия пептидных биорегуляторов потребовало теоретического изучения процесса деградации этих соединений под действием ферментов, что и было сделано нами в данной работе.
Актуальность темы диссертации. Изучение функционирования биологических молекул, среди которых пептиды занимают, несомненно, важное место, является одной из актуальных задач биохимии и молекулярной
2 биологии. Одно из важнейших направлений, развиваемых в настоящее время, связано с представлениями о том, что регуляция и координирование функций организма может осуществляться за счет фрагментов, образующихся в результате ферментативного метаболизма. В связи с этим данная работа, посвященная теоретическому исследованию процесса деградации пептидных соединений, является актуальной. Изучение возможности ферментативного образования фрагментов и их дальнейшего расщепления позволит прогнозировать соединения, обладающие монофункциональной биологической активностью и устойчивостью к действию ферментов (пролонгированное действие), что в дальнейшем может быть использовано для создания лекарственных препаратов.
Связь работы с крупными научными программами, темами.
Диссертационная работа выполнена в 1988 - 2000 гг. в лаборатории
биоорганической химии Института биоорганической химии НАН Беларуси в
рамках одного из разделов Государственной программы "Биооргсинтез" -
"Исследование роли белков, нуклеиновых кислот и липидов в
функционировании клетки" по темам: "Изучение влияния пептидов на гомеостаз человека, включающее пептид - рецепторное взаимодействие, мембранный транспорт и другие механизмы" (номер госрегистрации 19961102) и "Изучение межмолекулярных взаимодействий биологически активных пептидов и белков при сорбционной детоксикации с целью создания -искусственных органов" (номер гйсрегистрации 19961103).
Цель и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы являлось прогнозирование процесса деградации пептидных соединений с помощью методов математического моделирования. Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:
разработать теоретические подходы к моделированию процесса деградации пептидных биорегуляторов под действием ферментов крови;
провести моделирование процесса деградации пептидов с помощью разработанных подходов для следующих природных биорегуляторов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин, сывороточный фактор тимуса;
использовать результаты моделирования для прогнозирования фрагментов и их аналогов, обладающих селективным действием, более высокой биологической активностью и пролонгированным действием;
создать базу данных по ферментам крови;
разработать программное обеспечение для моделирования процесса деградации пептидов.
Объект и предмет исследования. Объекты исследования: природные пептиды различных классов - гипоталамические гормоны (люлиберин), нейрогипофизарные гормоны (вазопрессин), бомбезинолодобные пептиды
(литорин), тахикинины (вещество Р), пептиды с иммунологическим действием (сывороточный фактор тимуса).
Предмет исследования: процессы биологической трансформации природных соединений человека и животных.
Методология и методы проведенного исследования. В диссертационной работе успешно использованы следующие методы исследования:
методы математического моделирования (создание моделей биологических процессов, разработка и создание алгоритмов для моделирования этих процессов - деградации пептидных соединений под действием ферментов крови, создание программного обеспечения для реализации разработанных алгоритмов);
методы теории вероятности (определение вероятностных характеристик метаболизма);
методики синтеза (синтез пептидов в растворе);
аналитические методы идентификации соединений (тонкослойная хроматография и хроматография высокого разрешения на аналитическом жидкостном хроматографе ХЖ-1309);
методы исследования различных видов активности (анальгетической активности - метод "tail-flick"; поведенческой активности - измерение двигательной активности на приборе "Оптоваримекс" (США), изучение ориентировочно-исследовательской реакции в норковой камере, исследование выработки условной реакции активного избегания; метод локального гемолиза - для определения антителобразующих клеток в агарозе и в сыворотке - титр гемагглютининов).
Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые разработаны теоретические основы прогнозирования процесса деградации пептидных соединений.
Разработанная нами методика позволит:
рассматривать процесс деградации пептидных соединений до отдельных аминокислот;
определять различные фрагменты, образующиеся в процессе деградации под действием ферментов крови.
В настоящее время активно ведется поиск модифицированных аналогов пептидных биорегуляторов, обладающих селективным действием, устойчивостью к ферментативной деградации. Проведенное нами исследование возможности ферментативного расщепления пептидов и их фрагментов позволит выбирать пути модифицирования природных биорегуляторов с целью их защиты от расщепления пептидазами, а значит пролонгирования их функционального действия.
Дан прогноз фрагментов, отвечающих за проявление определенного вида активности для ряда пептидных биорегуляторов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин.
Практическая значимость полученных результатов. Разработанный подход может быть использован для изучения процесса деградации пептидных соединений под действием различного набора ферментов в зависимости от предполагаемой среды их локатизации. Данная методика прошла проверку при прогнозировании процесса деградации следующих пептидов: вещество Р, вазопрессин, люлиберин, литорин, сывороточный фактор тимуса.
На основании полученных прогнозов синтезированы аналоги пептидных биорегуляторов, имеющие монофункциональную активность. Полученные аналоги значительно превосходят по активности природные биорегуляторы и оказывают свое действие в дозах в несколько раз, а иногда на несколько порядков меньших, чем для природных соединений.
В настоящее время проводятся углубленные биологические испытания аналогов вазопрессина.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Теоретическое моделирование процесса деградации пептидных биорегуляторов.
-
Программный комплекс для моделирования процесса деградации пептидных соединений и созданная база данных по ферментам крови.
-
Результаты прогнозирования фрагментов, образующихся с наибольшей вероятностью, для следующих пептидных соединений: вещества Р, вазопрессина, люлиберина, литорина, сывороточного фактора тимуса.
-
Прогноз возможных модификаций природных биорегуляторов с целью их защиты от действия пептидаз.
-
Новые аналоги пептидных биорегуляторов.
Личный вклад соискателя. Лично автором выполнено следующее:
разработаны теоретические подходы к моделированию процесса деградации пептидных соединений под действием ферментов крови;
проведено моделирование процесса деградации пептидов с помощью разработанных подходов для вещества Р, вазопрессина, люлиберина, литорина, сывороточного фактора тимуса;
получены наборы фрагментов, образующиеся с наибольшей вероятностью;
дан прогноз возможных модификаций природных биорегуляторов с целью их защиты от расщепления пептидазами;
создана база данных по ферментам крови;
разработан программный комплекс для моделирования процесса деградации пептидных соединений.
Синтез веществ, использовавшихся в работе, проведен сотрудниками Института биоорганической химии НАН Беларуси - к.х.н. Егоровой СВ., к.х.н. Галюк Е.Н., к.х.н. Мартинович В.П. Биологическое тестирование вещества Р и
5 его фрагментов на спазмогеннуто активность выполнено сотрудницей Института биоорганической химии Пташкиной Л.П.; вазопрессина и его фрагментов (на поведенческую активность), люлиберина и его фрагментов (на аналгетическую активность) - коллегами из МГУ им. М.В. Ломоносова (кафедра академика РАМН И.П. Ашмарина); литорина и его фрагментов на терморегуляшгонную активность выполнено коллегами из Института химической физики РАН (под руководством к.б.н. Емельяновой Т.Г.); сывороточного фактора тимуса и его аналогов на иммунотропную активность -коллегами из Санкт-Петербургского госуниверситета.
Тема работы и планы ее проведения предложены научным руководителем, который принимат также участие в обсуждении результатов и их оформлении в виде статей.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы докладывались на VII Республиканской конференции молодых ученых - химиков ЭССР (Тарту, 1987), на XX школе по автоматизации научных исследований (Чолпон - Ата, 1987), на II Международном симпозиуме по молекулярным аспектам химотерапии (Гданьск, 1988), на 9 Молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически активным соединениям (Ереван, 1988), на Всесоюзном симпозиуме с участием иностранных специалистов "Структура иммунорегуляторных пептидов" (Москва, 1988), на Межреспубликанской научно - практической конференции "Синтез, фармакология и химические аспекты новых психотропных и сердечно - сосудистых веществ" (Волгоград, 1989), на Всесоюзной научной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы" (Москва, 1989), на VI Межуниверситетской конференции "Биологические мембраны в норме и патологии" (Кутаиси, 1989), на Республиканской научной конференции "Математическое моделирование и вычислительная техника" (Гродно, 1989), на II Международном конгрессе теоретической органической химии (Торонто, 1990), на 1 Международной научной конференции "Социально - экономическое развитие Республики Беларусь на рубеже XX и XXI веков: анализ, перспективы" (Гродно, 1997), на III съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1998), на IV съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск,2000).
Опубликованность результатов. Основные результаты диссертации отражены в 5-ти статьях, тезисах 11-ти докладов и авторском свидетельстве. Общее количество страниц опубликованных материалов -38.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (глава 1), основной части, содержащей теоретическое исследование процесса деградации пептидных соединений различных классов под действием ферментов крови (главы 2 - 4),
анализа результатов прогноза на основе экспериментальных данных (глава 5), заключения, списка литературы и приложения.
Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 40 таблиц, библиография составляет 249 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.