Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека Морозкин, Евгений Сергеевич

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Морозкин, Евгений Сергеевич. Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека : диссертация ... кандидата химических наук : 03.01.04 / Морозкин Евгений Сергеевич; [Место защиты: Ин-т хим. биологии и фундамент. медицины СО РАН].- Новосибирск, 2012.- 147 с.: ил. РГБ ОД, 61 13-2/34

Введение к работе

Актуальность проблемы. Тот факт, что дезоксирибонуклеиновые кислоты постоянно присутствуют во внеклеточной среде культивируемых клеток in vitro, а также в биологических жидкостях и в межклеточном пространстве in vivo в настоящее время не вызывает сомнений. Показано, что внеклеточные ДНК (внДНК) имеют в основном эндогенное происхождение, стабильны в течение длительного времени, переносятся током крови и лимфы и могут быть обнаружены далеко от места локализации «родительских» клеток.

Перечисленные факты позволяют использовать внДНК как источник диагностического материала для выявления специфических маркеров заболеваний, связанных с нарушением функций генетического аппарата клеток, в частности онкологических заболеваний. Определенный успех исследователей в поиске ДНК-маркеров онкологических заболеваний привел к тому, что кровь или плазму крови стали называть "жидкой биопсией", так как анализ внДНК крови позволил с определенной чувствительностью и специфичностью не только диагностировать опухоль, но и определять тканевую принадлежность заболевания.

Однако, несмотря на то, что эта область интенсивно развивается, на рынке медицинских аналитических систем до сих пор нет аккредитованных FDA диагностических методов, основанных на анализе внДНК. Анализ неудач, показал, что наряду с очевидными факторами, такими как несовершенство используемых подходов, недостаточная чувствительность аналитических систем, отсутствие межлабораторных стандартов и несовпадение данных, полученных разными группами исследователей, выявляются более серьезные факторы, такие как несовпадение структуры и частот встречаемости ДНК-онкомаркеров в ткани и крови. Недостаток фундаментальных знаний о природе внДНК и процессах, обеспечивающих их генерацию, циркуляцию и выведение из кровотока не позволяет объяснить вышеперечисленные факты и, в конечном счете, осуществлять рациональный поиск циркулирующих ДНК-онкомаркеров для ранней малоинвазивной диагностики рака.

Во внеклеточной среде высших эукариот внДНК могут появляться в результате процессов клеточной смерти (апоптоз и некроз), а также по данным ряда авторов в результате секреции нуклеиновых кислот клетками и внеклеточного синтеза. Однако данные о секреции ДНК клетками и внеклеточном синтезе ДНК были получены более 30 лет назад и в настоящее время не представляются достаточно убедительными и требуют проверки с использованием современных молекулярно-биологнческпх подходов. В отличие от механизмов активной секреции ДНК клетками, механизмы индукции и развития апоптоза изучены достаточно глубоко. Тем не менее, в контексте генерации внДНК ряд вопросов, принципиальных для понимания фундаментальных основ формирования пула внДНК, остаются открытыми. В частности, мало изученным остается алгоритм гидролиза различных участков хромосом при помощи апоптотических нуклеаз, который может определять относительную представленность последовательностей внДНК. Решение этих вопросов позволило бы не только оптимизировать поиск мишеней для диагностических методов, но и значительно продвинуться в изучении механизмов, участвующих в генерации внДНК и реализации их функций.

Целью работы являлось выявление клеточных механизмов, обеспечивающих генерацию внеклеточной ДНК, а также исследование влияния этих механизмов на состав последовательностей внеклеточной ДНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

Исследовать влияние индукторов и ингибиторов активной секреции и апоптоза на концентрацию внеклеточной ДНК в культурах клеток человека.

Исследовать возможность синтеза ДНК вне клеток человека.

Выявить отличия в представленности последовательностей между внеклеточной и геномной ДНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ с последующим клонированием и секвенированием выявленных районов хромосом.

Научная новизна и практическая ценность работы. В рамках первой части работы впервые было проведено комплексное исследование возможных механизмов генерации внДНК в культурах первичных эндотелиоцитов, фибробластов и клеток линии HeLa. При помощи индукции/ингибирования Гольджи-зависимого и Гольджи-независимых путей секреции белков было показано, что процессы активной секреции не участвуют в генерации внДНК. При помощи инкубации клеток с биотинилированным аналогом dUTP и последующим ПЦР анализом аффинно выделенной биотинилированной внДНК опровергнута гипотеза о возможности синтеза ДНК вне клеток. Показано, что внеклеточный синтез ДНК наблюдается только в культурах клеток, инфицированных мнкоплазмой. При помощи индукции/ингибирования апоптоза было показано, что основным источником внДНК в культуре клеток, культивируемых в нормальных условиях, является апоптоз. Во второй части работы был исследован состав последовательностей внДНК, генерируемых в результате апоптоза, с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. В результате проведения двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ было обнаружено, что внДНК отличается по составу последовательностей от геномной ДНК. Отличия в представленности были обнаружены в составе прицентромерного района хромосомы 9, а также дистальных плечей акроцентрических хромосом. В результате микродиссекции флуоресцентно меченых зондов, гибридизующихся в районе 9ql2, с последующей амплификацией, клонированием и секвенированием было показано, что среди секвенированных клонов наиболее представлены фрагменты последовательности сателлита 3. Показанная ранее транскрипционная активность в районе 9ql2 и экспрессия сателлитной РНК 3 указывает на то, что процесс апоптоза приводит к обогащению внДНК декомпактизованными районами хромосом. Данные о том, что районы декомпактизованного хроматина перепредставлены в составе внДНК крови могут быть использованы для оптимизации поиска ДНК-онкомаркеров, патологически трансформированных клеток, с измененным относительно нормальных клеток профилем плотности упаковки хроматина.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на международной конференции «Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids» (Новосибирск, Россия, 2003г), V, VI и VII международных конференциях «Circulating nucleic acids in plasma and serum» (Москва, Россия, 2007; Гонконг, Китай, 2009; Мадрид, Испания, 2011). Результаты диссертации были доложены на международной конференции «Физико-химическая биология»

(Новосибирск, Россия, 2011), на II международной конференции «Геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, Россия, 2011).

Структура її объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 147 страницах, содержит 43 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 283 литературных источника.

Похожие диссертации на Механизмы генерации и состав последовательностей внеклеточных ДНК в культуре клеток человека