Содержание к диссертации
стр.
ВВВДЕНИЕ 9
ГЛАВА I. Объекты и методы исследований 15
Объекты исследований 15
Состав культуральных сред „ . . 19
Методы культивирования микроорганизмов ....... 21
Измерение Н2 24
Разрушение клеток 25
Определение активности ферментов . . 26
1.6.1. Гидрогеназа 26
Восстановление акцепторов н2 26
Выделение н2 28
Катализ обменных реакций 29
1.6.2. Нитрогеназа 30
I.6.2.I.' Восстановление ацетилена до этилена . . . ЗЇ
Включение 15и2 в клетки и их отдельные 32 фракции
Образованию н2 33
1.6.3. НАД(Ф)-редуктазы 83
Восстановление акцепторов электрона ... 33
Окисление восстановленного бензил-виологена 35
Восстановление НАД 35
Супероксиддисмутазы (СОД) 36
Каталаза 37
Формиатдегидрогеназа 37
Аденилилсульфатредуктаза 37
1.7. Очистка ферментов и переносчиков электронов .... 38
I.7.I. Гидрогеназы .... 38
Нитрогеназа 42
Активирующий нитрогеназу фермент (ШФ) .... 45
НАД(Ф)-редуктазы 46
Формиатдегидрогеназа 52
Лденилилсульфатредуктаза 52
Супероксиддисмутаза 52
Ферредоксіш 55
Флаводоксин 58
1.7.10. Цитохромы . 58
1.8. Определение относительной молекулярной массы и
субъединичного состава ферментов и переносчиков
электрона . 61
Метод гель-хроматографии 62
Электрофорез в ПААГ 62
1.9. Определение изоэлектрической точки и чистоты
получаемых препаратов 63
Определение содержания металлов и кислото-лабильной серы 64
Определение окислительно-восстановительного потенциала 66
Определение аминокислотного состава 67
Определение содержания флавинов 67
Определение спектров поглощения и ЭПР 67
Определение аммиака 68
Определение хлорофилла 68
Определение белка 68
Определение кислорода 69
Получение хлоропластов 69
Иммобилизация гидрогеназы и ферредоксина 69
стр. ГЖВЛ 2. Образование и потребление молекулярного водорода
фототрофными и хемотрофными микроорганизмаші ... 71
2.1. Образование водорода 71
2.1.1. Пурпурные бактерии 72
Образование н2 растущими культурами ... 76
Образование н2 суспензиями клеток .... 79
Образование Н2 экстрактами клеток .... 89
Цианобактерии 91
Зеленые водоросли . 105
Хемотрофные бактерии 118
2.2. Использование водорода 122
2.2.1. Фототрофные микроорганизмы 123
Пурпурные бактерии 123
Цианобактерии 128
Зеленые водоросли 130
2.2.2. Хемотрофные бактерии 130
Заключение 134
ГЛАВА 3. Свойства гидрогеназ 139
Локализация гидрогеназ 140
Состав и структура 142
Молекулярная масса и субъединичный состав . . 142
Аминокислотный состав 146
Химическая природа и структура активного
центра 148
Спектральные свойства 148
Влияние некоторых ингибиторов на активность гидрогеназ 150
Содержание металлов и серы 151
стр.
3.3. Доноры и акцепторы электронов, взашлодействующие
с гидрогеназами 153
Кинетика реакций, катализируемых гидрогеназами . . 160
Стабильность и активность гидрогеназ 161
Температура 161
Кислород 165
Действие восстановителей 172
Ионы металлов 173
Концентрация ионов водорода и ионная сила буфера 174
иммобилизация гидрогеназ 176
3.6. Регуляция синтеза и активности гидрогеназ 178
Заключение 186
ГЛАВА 4. Нитрогеназа и ее роль в образовании ни микро
организмами 189
Активность нитрогеназы у фототрофов 190
Регуляция синтеза нитрогеназы 192
Температура и рН среды 192
Влияние рОр 193
Интенсивность света и скорость роста 196
Источники азота 199
4.3. Свойства нитрогеназы пурпурных бактерий 204
Доноры электронов 205
Потребности в энергии 212
Фермент, активирующий нитрогеназу 216
Стабильность нитрогеназы 217
Образование н2, катализируемое нитрогеназои. . 219 Заключение 222
стр.
ГЛАВА 5. НАД(Ф)-редуктазы 224
Регуляция синтеза НАД(Ф)-редуктаз 226
Локализация НАД(Ф)-редуктаз 229
Спектры поглощения и природа активного центра . . . 230
Молекулярная масса и субъединичный состав 233
Стабильность 236
Катализируемые реакции и выполняемые функции . . . 237 Заключение 243
ГЛАВА 6. Переносчики электронов, участвующие в функциони
ровании гидрогеназ и нитрогеназ . 245
Ферредоксины 245
Флаводоксины 254
Цитохрош 254
Заключение 263
ГЛАВА 7. Фотообразование н2 биокаталитическими системами,
содержащими хлоропласти 265
Хлоропласти 267
Гидрогеназа 269
Переносчики электронов 270
Интенсивность света 271
Действие ингибиторов и разобщителей электрон-транспортной цепи 272
Заключение 273
ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 274
ВЫВОДЫ 289
ЛИТЕРАТУРА 293
Список сокращений:
НАД(Ф)(Н) - никотиналщдадениндинуклеотид(фосфат) окисленный
(восстановленный) АТФ, ДЦФ - аденозин-5'-ди(три)фосфат ФМН - флавинмононуклеотид ФІЩ - фяавішаденшїдинуклеотид MB - метилвиологен БВ - бензилвиологен СОД - супероксиддисмутаза ПААГ - полиакриламидный гель ДТТ - дитиотреитол
ДЭАЭ-целлкшоза - диэтилаглиноэтил целлюлоза HEPES - Н-2-оксиэтилпиперазин-1Т,-2-этансульфоновая кислота ШФ - аденозинмонофосфат АНФ - активирующий нитрогеназу фермент Фд - ферредоксин
мг - относительная молекулярная масса Н2А - донор электронов Ух - убихинон Бх - бактериохлорофилл Фп - флавопротеид Хл - хлорофилл Мх - менахинон ФС - фотосистема Пц - пластоцианин Бф - бактериофеофитш Пх - пластохинон ПХМБ - п-хлормеркурибензоат ФКФ - п-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон
ГС - генерирующая система
ХА@ - хяорамфеникол
Диурон - дихлорфенил-1,1-дшлетилглочевина
ДШ> - 2,4-динитрофенол
ДХФИФ - 2,6-дшсяорфенолиндофенол
D - скорость протока
ШС - її-метилфеназинме то сульфат
DsNa - додецилсульфат натрия
HiPlP - высокопотенциальный белок
МС - метиленовий синий
Флд - флаводоксин
т1/р - период полуинактивации
М- скорость роста
ЭТД - электрон-транспортная цепь
ЖЦЦ - ид^'.И'-тетраглетил-п-фенилендиашш
БСА - бычий сывороточный альбумин
Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярный водород занимает важное место в метаболизме ряда микроорганизмов. Некоторые из них образую В2 в процессе своей жизнедеятельности, другие используют его в кач стве источника энергии и донора электронов. Известны также микроорганизмы, способные как выделять, так и оглощать молекулярный водород. Однако значение молекулярного водорода в жизнедеятельност разных микроорганизмов и пути его метаболизма стали выясняться сравнительно недавно.
Особенно повысился интерес к микроорганизмам, способным выделять и потреблять молекулярный водород в связи с практическим значением этих процессов, а именно получением Ej> как горючего газа в целях восполнения энергетических ресурсов, а также использовании его в других целях, в том числе получении микробной биомассы, богатой белком. Практическое значение имеют также некоторые метаболиты и ферменты, образуемые водородвнделяющими и водородисполь-зующими микроорганизмами. К числу таковых относятся гидрогеназы и нитрогеназы, участвующие в метаболизме молекулярного водорода и азотфиксации.
Среди различных микроорганизмов, выделяющих и(или) потребляющих Eg, большое внимание в настоящее время привлекают фототрофы, способные к непосредственной биоконверсии энергии света. В связи с выяснением роли молекулярного водорода в жизнедеятельности разных фототрофных микроорганизмов, а также проблемой возобновления энергетических ресурсов путем повышения эффективности использования солнечной энергии, актуальными в настоящее время являются следующие направления исследований:
поиск и селекция среди микроорганизмов, в том числе фото-трофов, активных продуцентов водорода;
выяснение условий образования ими H^t а также путей его
метаболизма и создание на этой основе модельных систем, образующих молекулярный водород;
3) исследование состава и свойств ферментов, а также переносчиков электрона, участвующих в метаболизме молекулярного водорода (гидрогеназ, нитрогеназы, низкопотенциальных переносчиков электрона).
По этим направлениям развивались и наши исследования, начатые еще в 1965 г., когда о метаболизме молекулярного водорода у фототрофных микроорганизмов было известно сравнительно мало. Наряду с фототрофами объектами исследования в сравнительном плане был ряд хемотрофных микроорганизмов.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение условий и значения процессов выделения и поглощения молекулярного водорода в жизнедеятельности разных фототрофных и хемотрофных микроорганизмов, свойств ферментов и переносчиков электрона, участвующих в метаболизме el, а также определения характера взаимосвязей этого процесса с азотфиксацией. Представлялось кроме того важным разработать биокаталитические системы, содержащие хлоропласты, способные к эффективному образованию молекулярного водорода.
Конкретные задачи работы состояли в следующем.
Отбор активных продуцентов молекулярного водорода среди микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам.
Оптимизация условий образования ими молекулярного водорода.
Выяснение путей, ведущих к выделению разными микроорганизмами н2 в зависимости от условий среды.
Исследование свойств ферментов и переносчиков электрона, участвующих в метаболизме водорода.
о. Создание модельных систем, способных к выделению Е0 на
- II -
основе биофотолиза воды.
Работа выполнена на уровне растущих культур, суспензий клеток, очищенных и гомогенных ферментов, а также реконструированных полиферментных систем с использованием разных методов.
Научная новизна. В результате проведенных исследований выяснены основные условия и факторы среды, от которых зависит образование Н2, и пути образования молекулярного водорода у микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам.
Дана оценка эффективности образования н2 разными представителями фототрофных и хемотрофных микроорганизмов, ранее не изученных или мало изученных в этом плане, и отобраны наиболее активные штаммы.
Разработан метод управляемого непрерывного культивирования фототрофных микроорганизмов, позволяющий получать высокий выход биомассы с заданными параметрами, а также обеспечивающий эффективное образование шли молекулярного водорода и азотфикса-пию.
Оптимизированы условия для высокого выхода н2 растущими культурами и суспензиями клеток ряда фототрофных бактерий.
Показано, что образование н2 у азотфиксирующих фототро-фов при освещении катализирует нитрогеназа, тогда как гидрогена-за в таких условиях обычно участвует в его поглощении.
Выделены и охарактеризованы основные ферменты (гидроге-назы, НАД- и НАДФ-редуктазы, супероксиддисглутазы) и переносчики электронов (ферредоксины, флаводоксин, цитохромы), участвующие в образовании микроорганизмами н2 и азотфиксации.
Установлено, что у некоторых микроорганизмов гидрогеназа имеет конститутивный характер, а у других регулируется по типу репрессия-депрессия, а также индукции.
Исследована взаимосвязь между гидрогеназой и нитрогена-
зой в метаболизме водорода на уровне целых клеток и полиферментных систем.
8. Созданы модельные системы с использованием хлоропластов, ферментов (гидрогеназ, нитрогеназы) и переносчиков электрона, выделяющих молекулярный водород в присутствии света в результате биофотолиза воды.
Практическое значение работы. Результаты исследований представляют собой физиолого-биохимическую основу для получения молекулярного водорода как топлива микробиологическими способами, а также биомассы фототрофных їликроорганизглов как источника ряда практически важных ферментов (гидрогеназ, нитрогеназы, НАД- и НАДФ-редуктаз, супероксиддисмутаз) и других полезных продуктов. Некоторые из выделенных и исследованных ферментов (гидрогеназы и НАД-редуктазы) нашли применение в инженерной энзимологии для разработки биохимического топливного элемента (совместно с отделом биокинетики МГУ) и создания модельных систем биофотолиза воды для получения Н2 (совместно с лабораторией фотохимии Института биохимии им. А.Н.Баха). Разработан способ изготовления їлодельных электродов для реакции окисления н2 и показана принципиальная возможность создания газодиффузионного водородного электрода на основе иммобилизованной гидрогеназы пурпурной серобактерии Thio-capsa roseopersicina (Ярополов, Гоготов и др., 1982).
Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались на Всесоюзных Баховских коллоквиумах но биологической фиксации азота (Москва, 1972; Канев, 1976; Чернигов, 1980; Тбилиси, 1983), Всесоюзных и международных конференциях по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, 1972, 1978, 1983), Всесоюзных биохимических съездах (Ташкент, 1969; Ленинград, 1979), Международных симпозиумах по прокариотным фотосинтезирующим микроорганизмам (Фрайбург, ФРГ, 1973; Оксфорд, Англия, 1980; Бомба-
- ІЗ -
но, Франция, 1982), Международном семинаре "Происхождение жизни" (Москва, 1974), XII Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Международном симпозиуме "Образование и использование микроорганизмами газов" (Геттинген, ФРГ, 1975), Советско-американском семинаре "Современные достижения в получении и использовании иммобилизованных ферментов" (Москва, 1975), Международном семинаре "Физико-химические аспекты транспорта электронов в ферментных системах" (Москва, 1975), Научной сессии Отделения биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединений АН СССР (Москва, 1975), Всесоюзном совещании "Управление биосинтезом водородных бактерий и других хемоавтотрофов" (Красноярск, 1976), X Международном конгрессе по биохимии (Гамбург, 1976), Всесоюзных симпозиумах "Получение и прршенение иммобилизованных ферментов" (Абовян, 1977; Ленинград, 1980), Международных симпозиумах "Рост микроорганизмов на с .j-соединениях (Пущино, 1977; Шеффилд, Англия, 1980), Всесоюзных совещаниях "Проблемы фиксации молекулярного азота" (Пущино, 1977, 1979), Международном симпозиуме "Гидрогеыазы: их каталитическая активность, структура и функция" (Геттинген, ФРГ, 1978), Международной конференции "Альтернативные источники энергии" (Вашингтон, США, 1978), ІУ и У Международном конгрессе по фотосинтезу (Рединг, Англия, 1977; Халькидейки, Греция, 1980), Всесоюзной конференции "Многоядерные окислительно-восстановительные металлофергленты" (Черноголовка, 1978), Международном симпозиуме "Инженерная энзимоло-гия" (Тбилиси, 1978) и "Биоконверсия солнечной энергии" (Пущино, 1983), Советско-шведском симпозиуме по физико-хиглической биологии (Москва-Пущино, 1978), XII Международном конгрессе по микробиологии (Мюнхен, ФРГ, 1978), Всесоюзном семинаре "Полиферментные системы" (Неринга, 1980), Всесоюзной конференции "Пути преобразования солнечной энергии" (Черноголовка, 1981) и "Фотоката-
литическое преобразование солнечной энергии" (Новосибирск, 1983), Всесоюзной конференции по проблемам микроэлементов в биологии (Кишинев, 1981).
Публикации. По материалам диссертации опубликована монография (в соавторстве), 74 печатных работ, тезисы и материалы докладов по указанным вьше конференциям и получено одно авторское свидетельство на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, в которых рассмотрены основные литературные данные и результаты собственных исследований, общего заключения, выводов и списка цитируемых работ. Работа содержит 447 страниц машинописного текста, 29 рисунков и 91 таблицу. Список литературы содержит 475 наименований, в том числе 353 иностранных работы»
