Содержание к диссертации
стр,
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Молекулярно-биологические аспекты проблемы хронического лимфолейкоза 8
Энзиматическое метилирование ДНК в клетках животных 14
ДНК-метилазы клеток эукариот 30
Биологическое значение метилирования ДНК 39
?ЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45
ПЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 64
Метилирование инвертированных повторенных последовательностей ДНК из лимфоцитов крови здоровых и больных хроническим лимфо-лейкозом коров 64
Усовершенствование метода определения ДНК-метилазной активности в экстрактах животных тканей 73
Неэнзиматическая модификация ДНК в присутствии s-аденозилметионина 83
Выделение и очистка ДНК-метилаз из лимфоцитов крови здоровых и больных хроническим лимфолейкозом коров 96
Свойства ДНК-метилаз из лимфоцитов крови здоровых и больных хроническим лимфолейкозом коров 109
стр.
ГЛАВА ІУ. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 122
ВЫВОДЫ 128
ШТЕРАТУРА
- 4- -СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
^фер А - 20 мМ Трис-HCl (рН 7,8), 5 мМ ЭДТА, I мМ ДТТ,
0,2 мМ PMSP, 10% глицерин БЛ - вирус бычьего лейкоза ЗН - додецилсульфат натрия ГТ - дитиотреитол
ХВД - жидкостная хроматография высокого давления
5Б - натрий-фосфатный буфер
Ш - оксиапатит
ЗР - стандартный солевой раствор: 0,15 М NaCi + 0,015 М
цитрат натрия UX - тонкослойная хроматография ЯЛ - хронический лимфолейкоз ЦТА - этилендиаминтетраацетат
аденин
цитозин
гуанин
т - длинные концевые повторы
рс - 5-метилцитозин
yiSF - фенилметилсульфонилфторид
ш - s-аденозилгомоцистеин
ш - s-аденозилметионин
IBA - s-изобутиладенозин
- тимин
kzac - 5-азацитидин
Введение к работе
Актуальность темы. Лейкозы являются актуальной и сложной про-пемой современной биологии, медицины и ветиринарии. Однако моле-улярные основы этой болезни до сих пор не совсем ясны. Считают, го причина злокачественной трансформации может быть связана с на-^шением нормального функционирования генома (Marx, 1984; Santos Ь al., 1984).
В функционировании эукариотической клетки важную роль игра-г метилирование ДНК. Показано, что эта модификация генома может эинимать участие в регуляции транскрипции, клеточной дифференци-звке и структурировании хроматина (Ванюшин, 1983; Cooper, 1983). литературе, посвященной изучению метилирования ДНК у животных, 1вно высказывалось предположение, что одна из причин опухолевой эансформации клеток связана с изменением характера метилирования знома. И действительно, большинство изученных опухолей животных человека характеризуется аберрантным метилированием ДНК, а ис-іедование этой модификации стало новым, важным для медицины и зльского хозяйства направлением современной биологии. Недавно знаружена обратная корреляция между метилированием и экспресси-1 вирусной ДНК в геноме трансформированных клеток (Cooper, 1983).
Избирательное метилирование определенных цитозиновых остат-)В в геноме осуществляется специфическими ферментами - ДНК-мети-ізами. Свойства этих ферментов в животных клетках до сих пор еще іло изучены, неясен вопрос о природе и множественности метилаз в зрмальных и опухолевых клетках. Вместе с тем, согласно гипотезе )река и Сринивасана (Borek, Srinivasan, 1966), именно ДНК-мети-1зы могут играть существенную роль в злокачественной трансформа-іи клеток млекопитающих, вызванной онкогенными вирусами.Поэтому твнительное исследование характера метилирования ДНК и свойств
- б -
ІК-метилаз в норме и при хроническом лимфолейкозе имеет принци-іальное значение как для выяснения молекулярных основ лвикознои )ансформации, так и для понимания биологической значимости самой шиматической модификации ДНК у эукариот. Особую актуальность это-Г исследованию придает и то обстоятельство, что недавно доказана фусная природа лейкоза у крупного рогатого скота (Burny et al., 380).
Цель и задачи исследования.3^ Целью настоящей работы было ис-іедование характера метилирования палиндромных последовательнос-зй ДНК, а также изучение свойств ДНК-метилаз из лимфоцитов крови цоровых и больных хроническим лимфолейкозом коров. Для этого бы-д поставлены следующие задачи:
1. Выделить из ДНК лимфоцитов крови здоровых и больных хрони-
зским лимфолейкозом коров палиндромные последовательности и оп-
зделить в них содержание 5-метилцитозина.
2. Очистить ДНК-метилазы из лимфоцитов крови здоровых и боль-
лх хроническим лимфолейкозом коров и изучить их физико-химические
войства и специфичность действия.
Научная новизна полученных результатов. Впервые обнаружена втономность метилирования палиндромных структур ДНК при хрони-зском лимфолейкозе крупного рогатого скота: в то время как уро-знь метилирования обычных повторяющихся последовательностей па-ает, метилирование палиндромов, наоборот, значительно возрастает, бнаружена реакция неэнзиматического метилирования ДНК под дейст-ием s-аденозилметионина. Впервые из лимфоцитов крови здоровых и ольных хроническим лимфолейкозом коров выделены препараты высоко-чищенных ДНК-метилаз и изучены их физико-химические свойства и пецифичность действия. Установлено, что в лимфоцитах крови боль-
' В постановке задач исследования принимала участие к.б.н.Н.Н.Бурцева.
шх хроническим лимфолейкозом коров присутствует дополнительная ЦНК-ме ти лаза, отличающаяся по хроматографическим свойствам, оптимуму рН и сайт-специфичности от ДНК-метилазы нормальных лимфоцитов. Сем самым показано,что при хроническом лимфолеикозе коров происходит не только специфическое изменение уровня метилирования генома, зо и появление нового,дополнительного ДНК-метилирующего фермента.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты имеют существенное теоретическое значение, поскольку открывают принципиально новый перспективный подход к расшифровке монокулярных механизмов нарушения клеточной функции при лейкозах в эезультате искажения метилирования генома. Результаты данной рабо-сы важны также для понимания биологической роли энзиматической модификации ДНК у эукариот. Использованный в работе усовершенствованный автором метод определения ДНК-метилазной активности,а так-ке методы выделения и очистки ДНК-метилаз из нормальных и лейкоз-шх лимфоцитов могут быть применены для выделения ДНК-метилаз из разнообразных животных тканей. Методы и результаты работы используются в Межфакультетской проблемной НИЛ им.А.Н.Белозерского,МГУ.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались за Ш Всесоюзной межуниверситетской конференции "Физико-химическая 5иология" (Тбилиси,1982), на У Всесоюзном симпозиуме "Молекулярное механизмы генетических процессов"(Москва, 1983), на УШ Все-зоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, [984), на совместном заседании отдела молекулярных основ онтогенеза Межфакультетской ПНИЛ им.А.Н.Белозерского и кафедры молекуляр-юй биологии Биологического факультета МГУ (Москва, 1984) и на за-зедании проблемной комиссии "Нормальное кроветворение" ЦНИИ ГПК ШН СССР (Москва, 1984).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печат-шх работ.
.-8-
