Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Непреходящая актуальность изучения регуляторных механизмов обусловлена их ключевым значением в процессах жизнедеятельности, многообразием выполняемых функций, появлением новых взглядов на роль и значимость отдельных механизмов в формировании ответа на различные стимулы. Как известно, в основе управления биологическими системами лежит принцип узнавания, белок-лигандного взаимодействия, индуцирующего на клеточном уровне каскад реакций в метаболических, транспортных, иммунологических процессах. Посттрансляционные модификации белков расширяют их функции в отношении распознавания, передачи сигналов и протеолиза. Эти процессы регулируют дифференцировку клеток и их пролиферацию (Егоров В.В. Мембранный механизм реакции клетки на внешний сигнал. Прикладная токсикология. 2011. № 1. С. 52-55; Иванов, А.С. Исследование межмолекулярных взаимодействий с помощью оптических биосенсоров, работающих на эффекте поверхностного плазменного резонанса / А.С. Иванов // Современные технологии в медицине. - 2012. - № 4. - С. 142-153; Southcott M.J. The expression of human blood group antigens during erythropoiesis in a cell culture system Blood. 1999. № 93. P. 4425-4435.). Важная роль в специфической и неспецифической защите организма, энергетическом, метаболическом обеспечении принадлежит крови и прежде всего эритроцитам, участвующим в поддержании динамического гомеостаза организма (Кондратенко И.В. Клеточные основы иммунного ответа: лекция. Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2003. Т. 2, № 3. С. 71-78; Муронец В.И. Нобелевская премия получена - загадки остались. История открытия инфекционных прионов. Сб. научно-популярных статей. Российская наука: мечта светла / под ред. чл-корр. РАН В.И. Конова. М.: Октопус-природа, 2006. С. 239-245; Patnaik S.K. Patterns of human genetic variation inferred from comparative analysis of allelic mutations in blood group antigen genes 2011. № 32(3). P. 263-271.).
Полиморфная система антигенов эритроцитов, включая ABO антигены, обладающая из 350 известных систем наибольшей иммуногенностью, обеспечивает механическую устойчивость мембран при трении о стенки капилляров, служит рецепторами эндогенных и экзогенных лигандов, выполняет защитную, структурную роль, обуславливает различия в физико-химических и антигенных свойствах организма. Есть данные о том, что иммуноглобулины обладают ферментативной активностью, расщепляя и фосфорилируя белки, полисахариды и липиды, нуклеиновые кислоты (Донсков СИ. Группы крови человека: рук. по иммуносерологии. 2011. - 1016 с; Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии СПб. 2004. 188 с; Antibody-mediated targeting of the uro-kinase-type plasminogen activator proteolytic function neutralizes fibrinolysis in vivo I Chem. 2008. Vol. 283, № 47. P. 32506-32515; M. Wahrmann et al. Anti-A/B an-
tibody depletion by semis elective versus ABO blood group-specific immunoadsorp-tion. European Renal Association. 2012. №27(5). P. 2122-2129).
Важное медицинское значение имеет определение биологической индивидуальности организма человека при чрезвычайном разнообразии и общности признаков популяции. Наряду с известными возрастными и индивидуальными особенностями метаболизма появились новые данные об ассоциированности метаболических, гемостазиологических показателей, клеточного состава с групповой принадлежностью крови (Гильмиярова Ф.Н. с соавт. Группы крови: биологическая вариабельность клеточного состава и метаболизма в норме и патологии М.: Известия, 2007. - С. 490; Golemis, Е.А. Protein-protein interaction. A molecular cloning manual N.Y., 2005. 938 p.; Anstee, D.J. The relationship between blood groups and disease I J.D. Anstee II Blood. - 2010. - № 115. - P. 4635-4643). Для раскрытия значения гликопротеинов А и В в формировании биологической индивидуальности человека актуальным является изучение роли малых молекул в процессах белок-лигандного взаимодействия с учетом принадлежности к группам крови. Это будет способствовать составлению представлений о возможностях управления иммунологическими, ферментативными, рецепторными процессами, в основе которых лежат лигандные взаимодействия. Интерес представляет этанол, дифильность молекулы которого, высокая химическая активность данного метаболита и нутриента, определяет важность изучения его влияния на процессы антиген-антительного и фермент-субстратного взаимодействия.
Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы: «Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).
Цель исследования: выяснить характер ответа гликолитических дегидро-геназ и гликопротеинов А и В на действие этанола.
Задачи исследования:
-
Определить содержание эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц с 0(1)- AB(IV) группами крови.
-
Охарактеризовать резерв метаболических свойств этанола, оценив спектр биологической активности in silico.
-
Изучить потенциальные свойства и биологическую активность антигенных детерминант системы АВ0 методом компьютерного моделирования.
-
Оценить влияние этанола на процессы взаимодействия гликопротеинов А и В с антителами в модельных экспериментах с визуализацией антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
-
Изучить прямые и опосредованные эффекты этанола на функцию глицераль-дегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидроге-назы.
Методология и методы исследования
Работа включала несколько этапов:
-
Определение эндогенного этанола ферментативным методом в крови клинически здоровых лиц с учетом групповой принадлежности по АВО системе.
-
Изучение потенциальных свойств и биологической активности этанола и антигенных детерминант системы АВО методом компьютерного моделирования.
-
Изучение влияния этанола на белок-белковые взаимодействия антигена с антителом в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов антигены А и В, моноклональные и естественные анти-А и анти-В антитела.
-
Визуализация антиген-антительных комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
-
Оценка влияния этанола на активность дегидрогеназ: глицеральдегидфос-фатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в ге-молизате и на гомогенные ферменты, с использованием кинетических методов исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования статистической обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0 «ANOVA».
Результаты исследований были представлены на II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании кафедр фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной
диагностикой и общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самарского отделения Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов, Самарского отделения научно-практического общества специалистов по лабораторной медицине (Самара, 2013).
Личное участие автора состояло в получении научных результатов, изложенных в диссертации, в проведении научно-информационного поиска, анализа, обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач, определении показателей групповой принадлежности крови и содержания эндогенного этанола у клинически здоровых лиц, в проведении серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, выяснении возможных свойств и механизмов действия этанола и антигенных детерминант А и В антигенов, выполнении статистической обработки полученных результатов исследования. Участие автора в сборе первичного материала и его обработке - более 90%, обобщении, анализе и внедрении в практику результатов работы - 100%. Все научные результаты автором получены лично.
Положения, выносимые на защиту
1. Уровень эндогенного этанола в крови клинически здоровых лиц.
Ассоциированность с группами крови по системе АВО. Возможные
метаболические эффекты этанола и антигенов А и В, установленные in silico,
прогнозируемые с помощью компьютерной системы Prediction of Activity
Spectra for Substances (PASS).
2. Влияние этанола на характер белок-белкового взаимодействия.
Уменьшение времени наступления агглютинации антигенов А(П) и В(Ш) с
моноклональными антителами, модифицированными этанолом. Особенности
антиген-антительного реагирования анти-А и анти-В антител с эритроцитами
АВ (IV) группы крови. Специфика межмолекулярного узнавания анти-А и анти-
В антител человека с антигенами. Визуализация антиген-антительных
комплексов методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
3. Действие этанола на каталитические белки с различным уровнем
структурной организации. Активация этанолом глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы.
Научная новизна
Получены новые сведения, раскрывающие роль малых молекул в белок-лигандных взаимодействиях белков с различными функциями. В серии модельных экспериментов установлено, что дифильная молекула этанола, обладающая активными физико-химическими свойствами, способна изменять процесс межмолекулярного узнавания антигена с антителом. Высокая биологическая актив-
ность этилового алкоголя показана нами в исследованиях in silico. Монокло-нальные анти-А и анти-В антитела, модифицированные этанолом, быстрее узнают и связываются с эритроцитами А(П) и В(Ш) группы крови. Специфику антиген-антительного взаимодействия отражают данные о более выраженной полноте агглютинации и укорочение времени узнавания антигена В с анти-В антителами. Сродство анти-А антител плазмы человека к антигену под влиянием этанола возрастает, а для анти-В антител наблюдается противоположный эффект. Индуцированные этанолом стерические, электростатические изменения в структуре антител и антигенов характеризуются группоспецифическими особенностями. Изменения более значимы для процесса узнавания антигена антителом, предшествующему образованию комплекса. Выяснено, что избирательное действие оказывает этанол и на ферментные белки разного уровня структурной организации. Характерен более значимый эффект на тетрамерную молекулу глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, чем на димерную структуру а-глицерофосфатдегидрогеназы. Это действие типично для изолированных ферментов и находящихся в естественном окружении. В условиях целостного организма, очевидно, за счет этого реализуется регуляция обменных процессов, усиление или замедление потока субстратов по различным метаболическим путям.
Показано, что не только иммуногенетическая индивидуальность организма, но и специфика ответа на различные стимулы обеспечивается групповыми антигенами АВО системы. Прогнозирование биологической активности А и В антигенов и механизмов ее реализации с помощью компьютерной системы Prediction of Activity Spectra for Substances (PASS) выявило полифункциональность и особенности свойств антигенов А и В. Более многообразный спектр эффектов и выявленных механизмов характерен для антигена В. Данные in silico позволяют по-новому оценить антиген-антительное взаимодействие, включающее не только связывание чужеродного молекулярного или клеточного материала, но и оказывающее фронтальный эффект на ферментативные метаболические, транспортные процессы, экспрессию генов. При этом групповая принадлежность крови определяет специфику ответа на внешние стимулы, составляя фено-типический признак, сопряженный с функцией белков различной структуры и выполняемой ими биологической роли, формируя индивидуальные метаболические признаки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты имеют теоретическое значение. Они раскрывают регуляторную роль этанола, определяющую характер межмолекулярного узнавания. Показано, что структурные особенности белков, уровень организации обуславливает специфику молекулярного ответа на действие этого биологически активного соединения. Экспериментально разработана и обоснована информативность использования модели антиген-антительного взаимодействия, применение конфокальной микроскопии с целью визуализации узнавания, степени
полноты взаимодействия антигенов и антител системы группы крови АВО. Отличия процесса агглютинации антигена А и антигена В с анти-А и анти-В антителами свидетельствуют об избирательности эффекта и аргументируют возможность оценки на этой модели действия биологически активных соединений, лекарственных веществ. Результаты, полученные на этой модели, служат обоснованием для роли интермедиатов, малых молекул, в регуляции белок-лигандных взаимоотношений при использовании их в качестве молекулярных зондов. Метаболиты, на долю которых приходится значительная часть клеточного и внеклеточного пространства являются регуляторами процессов, в основе которых лежат белок-лигандные взаимодействия. Они, очевидно, обеспечивают адекватность молекулярных процессов запросам организма. Это выявлено на примере этанола.
Изменение интенсивности катализа лактатдегидрогеназы, глицеральде-гидфосфатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы, усиливающееся под влиянием этанола, характеризует этот минорный компонент как регулятор ферментативных процессов, меняющий в разной степени активность ферментов с димерной и тетрамерной структурой молекулы, тем самым способствуя определенной направленности метаболических потоков.
Данные, полученные in silico с помощью программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), раскрывают многомерность биологической активности этанола и служат основанием для дальнейшего углубленного экспериментального изучения свойств, всего спектра возможного действия этого соединения. Данные, полученные при изучении in silico биологической активности антигенов А и В являются иллюстрацией их полифункциональности, возможности выполнения других, помимо канонических, функций в организме.
В прикладном отношении значение полученных результатов обуславливают необходимость при оценке данных клинико-лабораторного исследования учитывать отклонения в фонде метаболитов, так как это может отразиться на показателях активности ферментов, изменить антиген-антительное взаимодействие. Специфика ответной реакции антигенов и антител 0(I)-AB(IV) групп крови системы АВО определяет необходимость учета групповой принадлежности пациента при диагностике и назначении лекарственных препаратов.
В социальном отношении важным является сведения о наличии фонового уровня эндогенного этанола вне приема алкоголя, что необходимо учитывать при проведении медицинского освидетельствования на состояние опьянения. Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования используются в работе клинико-диагностической лаборатории клиник СамГМУ ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; в учебном процессе кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Рос-
сийской Федерации; кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Получен патент на изобретение № 2484480 «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие» от 10 июня 2013 г.
Конкурсная поддержка исследования
Данная работа выполнена при поддержке губернского гранта в области науки и техники за II полугодие 2012 г. «Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии»; гранта РФФИ, проект 13-04-9712 «Модель визуализации белок-белкового взаимодействия».
Публикации
Опубликовано 17 работ, из них по теме диссертации 17 научных работ общим объемом 0,6 печатных листа, в том числе 7 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Получен 1 патент, 10 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 156 страницах машинописного текста, иллюстрированы 25 таблицами и 20 рисунками, состоят из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 341 источник, из них 166 - отечественных и 175 -зарубежных.
![Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4500/209024.png "Влияние половых стероидов (этинилэстрадиола и левоноргестрела) на взаимодействие тромбин-фибриноген в кровотоке (экспериментальное исследование) [Электронный ресурс] Матейкович Елена Александровна")
