Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Функциональные нарушения тиамин-зависимых процессов в организме человека в наиболее яркой форме проявляются в виде расстройств нервной и кардиоваскулярной систем, приводят к развитию синдрома Вернике-Корсакова и, вероятно, служат одним из патогенетических факторов болезней Альзгеймера и Паркинсона (Gibson е.а., 2002). В связи с этим выяснение всех аспектов, касающихся биологической активности тиамина, имеет высокую социальную значимость и представляет собой актуальную проблему современной медико-биологической науки.
Наряду с ТДФ - кофактором мультиферментных комплексов окислительного декарбоксилирования а-кетокислот и транскетолазы - в тканях человека и животных присутствует ТТФ, функция которого в жизнедеятельности клетки неизвестна. Еще 5 лет назад возможная биологическая роль ТТФ рассматривалась исключительно исходя из представлений о специфической неко-ферментной функции тиамина в возбудимых тканях (Bettendorff, Wins, 1999). Однако в последнее время появляются все новые экспериментальные данные, которые не могут найти адекватной интерпретации в рамках этой гипотезы. Теперь уже не вызывает сомнений факт повсеместного распространения ТТФ в биологических объектах вне зависимости от их принадлежности к тем или иным таксономическим группам или индивидуальных особенностей организма (Makarchikov е.а., 2003). И это обстоятельство, предполагающее фундаментальную роль ТТФ в биологии клетки, диктует необходимость разработки новой концептуальной основы, которая могла бы послужить прочным фундаментом для дальнейших исследований. В экспериментах на бактериях и растениях установлено, что внутриклеточная концентрация ТТФ регулируется в ответ на внешние воздействия, такие как гипоксия или смена источника углерода, и это может указывать на существование функциональной связи ТТФ с адаптацией клетки к изменяющимся физиологическим условиям (Makarchikov е.а., 2003). В качестве первого шага к выяснению возможной роли ТТФ в молекулярных адаптационных механизмах представляется плодотворной гипотеза о его участии в регуляции и координации реакций энергетического обмена, протекающих в цитозоле и митохондриях клетки. В тканях млекопитающих концентра-
Прншпые обозначения и сокращенна: ТТФ - тияминтрифосфат, ТДФ - тиаминдифос-фат, ТТФаза - тиаминтрифосфатаза, СДГ - суюшнатдегидрогеназа, ГЩК - пируватдекзрбок-силаза, ЛДГ - лаггатдегидрогеназа, Г-6-Фаза - глюкозо-б-фосфатаза, ГДГ - глутаматдегид-рогеназа, СО - сульфитоксидаза, ТХУ - трихлоруксусяая кислота, ПААГ - полиакриламид-ныв гель, Pi - неорганический фосфат, ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование, ЭР - эндо-плазматяческий ретикулум, Кы - константа Михазлиса, K^b, - максимальная скорость реакции, *ог - каталитическая константа, v0 - начальная скорость реакции, [I] - концентрация ингибитора, pi - изоэлектрическая точка, Е, - энергия активации, т - молекулярная масса
ш ні) І і ' Щ ' ''
СПетербург
8М>УРК
2 ция ТТФ контролируется специфичной растворимой ТТФазой (КФ 3.6.1.28)
(Makarchikov, Chernikevich, 1992; Lakaye е.а., 2002; Makarchikov е.а., 2002), активность которой максимальна при рН 8,9. Механизмы регуляции этого фермента неизвестны, однако анализ аминокислотной последовательности и опыты in vitro свидетельствуют о возможности его фосфорилирования (Lakaye et al., 2004). Исходя из сказанного, можно предположить, что в тканях млекопитающих присутствует множественные формы растворимой ТТФазы, наличие которых является отражением двух различных аспектов рассматриваемой проблемы - компартментализации метаболизма ТТФ и регуляции активности фермента фосфорилированием. В связи с этим цель настоящей работы заключалась в обнаружении, идентификации и характеристике физико-химических и кинетических свойств множественных форм растворимой ТТФазы в тканях млекопитающих.
В задачи исследования входило:
модифицировать метод определения активности ТТФазы с целью его упрощения и повышения точности;
выяснить распределение и локализацию ТТФазной активности в субклеточных фракциях из почек быка;
идентифицировать фермент с ТТФазной активностью в митохондриях из тканей крысы и быка;
выделить, очистить и охарактеризовать митохондриальную форму ТТФазы из почек быка, исследовать возможность транспорта фермента в митохондрии;
выделить, очистить и охарактеризовать минорную форму растворимой ТТФазы из почек быка.
Объект и предмет исследования. Объектами исследования являлись почки и головной мозг быка (Bos taurus), почки, печень и головной мозг белых крыс (Rattus norvegicus). Предмет исследования - идентификация, физико-химические и кинетические свойства множественных форм специфичной растворимой ТТФазы.
Гипотеза. В тканях млекопитающих присутствуют множественные формы специфичной растворимой ТТФазы, что является отражением компартментализации метаболизма ТТФ в цитозояе и митохондриях и регуляции активности фермента фосфорилированием.
Методология и методы проведения исследований. Методологический подход заключался в выделении, фракционировании, очистке и исследовании изолированных субклеточных компонентов и макромолекул. В работе использовались методы стационарной ферментативной кинетики, дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобная и псевдоаффинная хроматография, ИЭФ, электрофорез в ПААГ, денситометрия, спек-трофотометрия, колориметрия.
Научная новизна я значимость. Впервые получены данные о субклеточном распределении ТТФазы в почках быка. Установлено сходство в рас-
пределенни активности фермента в почках н головном мозге, предполагающее общность путей метаболизма и функций ТТФ в клетках и тканях различной специализации.
Впервые показано, что в митохондриях млекопитающих локализован фермент с ТТФазной активностью. Фермент частично очищен из почек быка и идентифицирован как митохондриальная форма ТТФазы.
В почках быка впервые обнаружена минорная форма растворимой ТТФазы. Исследования физико-химических и кинетических свойств частично очищенного фермента позволяют предполагать, что данная форма фермента является фосфорилированной цитозольной ТТФазой.
Полученные результаты, свидетельствующие о множественной компар-тментализации ТТФазы в клетке и возможности ее регуляции фосфорилирова-нием, имеют важное теоретическое значение для разработки новой концептуальной основы дальнейших исследований одного из фундаментальных аспектов витаминологии - некоферментной функции тиамина.
Практическая значимость. Усовершенствован метод определения активности ТТФазы по концентрации ТДФ, основанный на биоспецифическом связывании ТДФ как кофермента с апоПДК. Благодаря изменению способа остановки реакции снижена трудоемкость и повышена безопасность работы, увеличена точность и скорость проведения анализа. Предлагаемый метод может использоваться в клинических лабораториях с целью диагностики нарушений обмена физиологически активных форм тиамина, а также в учебных лабораторных практикумах студентов биологических, сельскохозяйственных и медицинских специальностей. По результатам работы получена приоритетная справка № а20010777 гос. патента РБ от 19.09.2001.
Оптимизировано выделение субклеточных фракций из почек быка методом дифференциального центрифугирования. Тщательный подбор режимов центробежного ускорения и времени центрифугирования позволил значительно снизить перекрестное загрязнение получаемых фракций. Данный метод может быть использован в учебных и исследовательских целях.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При рН 8,9 ТТФазная активность регистрируется во всех субклеточных фракциях, выделенных из почек быка методом дифференциального центрифугирования. Активность ядерной, митохондриальной и микросо-мальной фракций обусловлена действием растворимого фермента.
-
В матриксе митохондрий клеток млекопитающих локализована специфичная ТТФаза, отличающаяся от цитозольного фермента физико-химическими и кинетическими свойствами.
-
Почки быка содержат минорную форму цитозольной ТТФазы, которая, вероятно, представляет собой фосфорилнрованный фермент.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования, статистическая обработка данных и аналитический обзор литературы осуществлены лично соискателем. Планирование исследований, обобщение и анализ получен-
ных результатов проведено с участием научного руководителя. В работе над
усовершенствованием метода определения активности ТТФазы принимала участие н.с. лаборатории энзимологии ИБХ НАНБ Лучко Т.А.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований представлены на XXXVI, XXXVII, XXXVHI и XXXIX съездах Польского биохимического общества (Познань, 2000; Торум, 2001; Вроцлав, 2002; Гданьск, 2003); 4-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» (Гродно, 2001); 5-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» (Гродно, 2002); международной конференции «Биохимические аспекты жизнедеятельности биологических систем» (Гродно 2000), Республиканской научно-практической конференции «Хроматографические методы в химии, экологии и медицине» (Гродно, 2002); международной научно-практической конференции «Сельское хозяйство - проблемы и перспективы» (Гродно, 2003); Республиканской конференции молодых ученых «Молодежь в науке» (Минск, 2003); общеинститутских научных семинарах ИБХ НАНБ (2001,2003).
Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках государственных программ фундаментальных исследований "Метаболизм" и "Регуляция и патогенез'' по заданиям НИР "Молекулярные механизмы реализации биологических функций витаминов Bt и В2" (1998-200ІГГ.), гос. per. № 19982495 и "Структурно-функциональные исследования тиаминтрифосфатазы, нуклеозидтрифосфатазы и транскетолазы в тканях животных в норме и при нарушениях углеводного обмена" (2002-2005 гг.), гос. per. № 20021190.
Онурликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 9 рецензируемых статей (4 в журналах, 1 в сборнике и 4 в материалах конференций) и 5 тезисов докладов. Общее количество печатных страниц - 40, лично автору принадлежит 27,8 (69,5 %).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, перечня сокращений и условных обозначений, общей характеристики работы, обзора литературы, главы материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключения и библиографического указателя, включающего 253 наименований. Работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и иллюстрирована 5 таблицами и 35 рисунками.