Введение к работе
Актуальность проблемы. В экономически развитых странах Европы и в США ежегодно более чем у 750000 пациентов развивается сепсис, летальность при котором может достигать 40-80%. Несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению сепсиса, количество подтверждённых случаев возрастает на -1,5% в год {Salomao etal, 2012).
В настоящее время в практической медицине нет эффективных средств защиты от грамотрицательного и грамположительного сепсиса. Активатором патологических процессов при сепсисе являются структурные компоненты бактериальных клеток (PAMPs - pathogen-associated molecular patterns) {Ray et al, 2013). У грамположительных клеток, наряду с другими PAMPs - это липотейхоевая кислота (ЛТК). У грамотрицательных -липополисахариды (ЛПС, эндотоксины). ЛПС также играют важную роль в развитии таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, метаболический синдром и др. {Мапсо et al, 2010). Поступая в кровяное русло, ЛПС сначала взаимодействуют с липополисахарид-связывающим белком, затем - с CD 14 мембранным белком клеток-мишеней (в том числе фагоцитов крови). После этого происходит передача ЛПС от CD 14 к MD-2 (лимфоцитарный антиген 96) и последующее образование двух комплексов ЛПС-МО-2-ТЕЕ1-4 (Toll-like receptor 4), которые впоследствии формируют гетеродимерный рецепторный комплекс в мембране клеток-мишеней {Park et al., 2009). Трансдукция сигнала от этого комплекса приводит к запуску клеточного ответа, на ранних стадиях которого происходит увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) фагоцитами и увеличение экспрессии факторов адгезии. В более поздний период происходит активация факторов транскрипции (в частности, NF-kB - ядерный фактор каппа В) и синтез провоспалительных цитокинов, среди которых первым секретируется TNF-a {Buttenschoen et al, 2010). ЛТК вызывает стимуляцию клеток врожденного иммунитета через активацию TLR-2, CD 14 и CD36 рецепторов {Weidenmaier, Peschel, 2008).
В развитии сепсиса и септического шока важная роль принадлежит клеткам врожденного иммунитета - фагоцитам (нейтрофилам, моноцитам, макрофагам), основной функцией которых является защита млекопитающих от бактериальной инфекции. Нейтрофилы играют ключевую роль в воспалительном ответе и одними из первых отвечают на действие ЛПС и ЛТК, которые вызывают активацию нейтрофилов и ингибируют их апоптоз, что приводит к увеличению продолжительности жизни этих клеток {El Kebir, Filep, 2010; Осапа et al, 2008). Наряду с нейтрофилами в системе врожденного иммунитета важная роль принадлежит макрофагам, которые происходят из моноцитов, и в качестве секреторных клеток участвуют во многих иммунных и воспалительных реакциях, в которых не участвуют нейтрофилы {Odegaard et al, 2011). Под действием ЛПС моноциты и макрофаги продуцируют различные цитокины и клеточные медиаторы и играют важную роль в воспалительном процессе.
Большинство грамотрицательных бактерий содержат S-форму ЛПС, в состав которой входит гидрофобный липид А, олигосахаридный кор и О-антиген. Помимо S-формы ЛПС, бактерии синтезируют и кор-дефектные молекулы ЛПС (R-хемотипы), имеющие в своем составе липид А и коровую часть разной длины. Кор-дефектные структуры обозначаются как Rb - Re-хемотипы, а структуры, имеющие полный внешний кор, как Ra-хемотип {Freudenberg et al, 2008). Известно, что при ряде патологий доля R- хемотипов ЛПС может возрастать {Anas et al, 2010). Действие S-формы эндотоксинов на фагоциты в настоящее время исследовано достаточно полно, в то время как действие различных R- хемотипов ЛПС изучено недостаточно.
В ответ на стресс организм выделяет эндогенные "сигналы опасности", способные действовать как мощные активаторы системы врожденного иммунитета, вызывая продукцию различных медиаторов. Ранее было показано, что при сепсисе и различных воспалительных заболеваниях происходит увеличение синтеза и продукции белков теплового шока, в частности БТШ70, играющего важную роль в механизме защиты организма млекопитающих
от теплового и других видов стресса (Gelain et al., 2011, Ed. Henderson, 2012). Показано, что введение экзогенного рекомбинантного БТШ70 снижает гибель животных в модели эндотоксинового шока, а также подавляет индуцируемую эндотоксином активацию нейтрофилов, т.е. защищает клетки от действия ЛПС {Rozhkova et al, 2010).
Свойства внутриклеточного БТШ70 изучены достаточно полно (Liu et al, 2012, Noble et al, 2012, Joly et al, 2010). Показано, что он обладает шаперонной активностью, а также имеет различные регуляторные функции (противовоспалительные, антиапоптотические) (Zorzi et al, 2011, Young, 2010). Однако, в настоящее время мало известно о механизмах взаимодействия внеклеточного (экзогенного) БТШ70 с клетками врожденного иммунитета и внутриклеточных сигнальных путях, участвующих в трансдукции его сигнала.
Для понимания защитных функций экзогенного БТШ70 необходимо комплексное исследование его действия на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги), которые являются первой линией защиты организма от бактериальных патогенов и PAMPs и, соответственно, в числе первых клеток взаимодействуют с ЛПС и ЛТК. Однако, все работы по исследованию защитного действия экзогенного БТШ70 были выполнены при использовании S-формы ЛПС. Отсутствуют данные по влиянию экзогенного БТШ70 на клетки врожденного иммунитета при действии разных хемотипов ЛПС. Поэтому представляет интерес исследовать защитные эффекты БТШ70 на разные типы клеток врожденного иммунитета от действия различных хемотипов ЛПС, а также от действия ЛТК. Цель работы: исследовать влияние экзогенного белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета при действии липополисахаридов разной структуры. Задачи исследования
-
Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на функциональную активность (продукцию АФК, TNF-a) нейтрофилов, моноцитов и макрофагов при действии ЛТК и разных хемотипов ЛПС Е coli.
-
Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на рецепторы CD lib нейтрофилов и TLR-4 моноцитов при действии разных хемотипов ЛПС Е coli.
-
Исследовать связывание, интернализацию экзогенного БТШ70, а также его влияние на ЛПС-индуцированную экспрессию TLR-2 и TLR-4 клетками врожденного иммунитета.
-
Выявить внутриклеточные сигнальные пути, задействованные экзогенным белком БТШ70, в защите фагоцитов при действии ЛПС.
Научная новизна. В работе исследовано влияние экзогенного рекомбинантного человеческого белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги) при действии на эти клетки разных хемотипов липополисахаридов Е. coli. Показано, что предварительная обработка экзогенным БТШ70 снижает индуцируемое ЛТК и различными хемотипами ЛПС Е. coli увеличение продукции АФК и TNF-a нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, а также вызывает снижение количества CD1 lb рецепторов нейтрофилов и TLR-4 рецепторов моноцитов.
Показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает продукцию TNF-a нейтрофилами и моноцитами с участием преимущественно TLR-4 - зависимой передачи сигналов.
Установлено, что экзогенный БТШ70 увеличивает количество рецепторов TLR-2 и TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов и не влияет на экспрессию мРНК TLR-2 и TLR-4 рецепторов макрофагов RAW 264.7.
Выявлены механизмы влияния экзогенного БТШ70 на внутриклеточные сигнальные пути с участием PLC, PI3K, р38, ERK, JNK и NF-кВ, вовлеченные в продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами при действии ЛПС.
Научная и практическая значимость. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов действия экзогенного БТШ70 на клетки врожденного иммунитета, что вносит важный вклад в оценку возможности использования БТШ70 в качестве основы для создания перспективных лекарственных препаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010, 2011, 2012); на международных конференциях "Biological mobility: from fundamental achievements
to nanotechnologies" (Pushchino, 2010, 2012); на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); на международной школе-конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2012), на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» (Пущино, 2012); на II Всероссийской школе-конференции молодых учёных с международным участием «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2012).
Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации опубликованы в 14 печатных работах, из них 4 - статьи в рецензируемых научных журналах, 3 статьи в сборниках и 7 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах
