Введение к работе
Актуальность темы исследования. В мировой практике для создания биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генетической инженерии и микробиологии для получения рекомбинантных ферментных препаратов с заданными свойствами, которые, в свою очередь, определяются типом гидролизуемого субстрата.
Наиболее востребованными ферментными препаратами, осуществляющими гидролиз таких сложных полимеров, как инулин и целлюлоза, являются инулиназы эндо-и экзо-деполимеразного действия, а также комплекс гидролитических ферментов, включающий в себя эндо-1,4-/?-глюканазу, экзо-целлобиогидролазу и /?-глюкозидазу соответственно.
Известно, что инулин является важным полисахаридом клетки растений семейства сложноцветных, в частности, топинамбура, представляющим собой линейные цепи/?-2,1-связанных молекул D-фруктофуранозы, которые заканчиваются остатком глюкозы на невосстанавливающем конце молекулы биополимера. Клубни топинамбура, урожайность которых в среднем составляет 30-40 т/га, обогащены инулином, содержание которого в клубнях достигает 80-90% от массы сухого вещества. Поэтому, применение ферментных препаратов инулиназ может не только увеличить эффективность гидролиза инулосодержащего сырья до простых Сахаров - фруктозы и глюкозы, но и позволит получать фруктоолигосахариды, являющиеся необходимыми компонентами функционального питания.
С другой стороны, основными полисахаридами клеточной стенки высших растений являются целлюлоза и гемицеллюлозы, составляющие, соответственно 40-50% и 30-40% от массы растительного сырья. Оптимизированный состав смесей основных компонентов целлюлазного гидролитического комплекса позволит сделать вывод о наиболее эффективном соотношении основных ключевых ферментов при гидролизе природных целлюлозосодержащих материалов.
В лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН ведутся работы со штаммом низшего гриба Penicillium ccmescens, зарекомендовавшим себя как простая и удобная лабораторная модель для получения рекомбинантных штаммов с заданными свойствами. Таким образом, актуальной задачей представлялось получение рекомбинантных ферментных препаратов, а также оптимизация их смесей для максимально эффективного гидролиза природного сырья до простых Сахаров, используя грибной реципиентный штамм Penicillium canescens.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключается в применении молекулярно-генетических подходов к созданию рекомбинантных ферментных препаратов, обладающих высоким гидролитическим потенциалом по отношению к
целлюлозо- и инулосодержащим субстратам, а также поиск оптимальных соотношений ферментных препаратов для высокоэффективного гидролиза природного сырья.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
Получить плазмидные конструкции, несущие гены инулиназ (экзоинулиназы (inuPj) Aspergillus awamori, эндоинулиназы (inuA) A.niger, а также /?-фруктофуранозидазы (fopA) A.oryzae на основе векторов, содержащих промоторы гена xylA (кодирующего ксиланазу А Penicillium canescens), гена bgal (кодирующего Р-галактозидазу P.canescens) и гена abfB (кодирующего арабинофранозидазу А P. canescens);
Получить плазмидные конструкции, несущие гены целлюлаз (целлобиогидролазы I и II (cbhl и cbh2)), эндоглюканазы II (egl2) P.verruculosum, а также /?-глюкозидазы (bgll) A.niger) на основе экспрессионного вектора, содержащего промотор гена ксиланазы А (xylA) P. canescens;
Провести трансформацию полученными плазмидами штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 AniaD и осуществить скрининг трансформантов. Получить новые ферментные препараты инулиназ и целлюлаз и исследовать их свойства;
Выделить в гомогенном виде и изучить свойства экзоинулиназы и эндоинулиназы, сравнить со свойствами соответствующих ферментов из природных штаммов;
Исследовать гидролитические свойства ферментных препаратов по отношению к целлюлозосодержащему и инулосодержащему сырью, а также определить оптимальное соотношение в них ключевых ферментов;
Определить компонентный состав ферментных комплексов, обладающих наиболее высокой эффективностью гидролиза растительного сырья.
Научная новизна и практическая значимость работы. Новизна работы состоит в получении новых эффективных ферментных препаратов с улучшенными гидролитическими свойствами на основе лабораторного грибного штамма P.canescens с использованием современных ДНК-технологий. Показано, что ферментные комплексы инулиназ и целлюлаз, полученные путем смешения новых ферментных препаратов, обладают увеличенной гидролитической активностью. Применение полученных в результате выполнения работы индивидуальных ферментных препаратов, а также их смесей, при гидролизе различных видов инулосодержащего (инулин топинамбура и измельчённые клубни топинамбура), а также целлюлозосодержащего (микрокристаллическая целлюлоза и измельчённая осиновая древесина) сырья позволяет достичь высокой степени его конверсии, что может быть использовано в ряде технологических процессов пищевой и биотехнологической промышленности.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором
международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010), четвёртой международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Москва, 2010), шестом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), а также московской школе конференции «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (159 ссылок). Диссертация содержит 130 страниц печатного текста, включает 52 рисунка и 28 таблиц.
