Введение к работе
Актуальность темы.
Гемофилия А и В - тяжелые наследственные заболевания, обусловленные функциональной неполноценностью или отсутствием факторов VIII или IX (FVIII, FIX) свертывания крови. Причиной заболеваний являются рецессивные мутации генов, локализованных в длинном плече Х-хромосомы - Xq28 и Xq27 соответственно. Заболевания встречаются с частотой 1:8 и 1:30 тысяч новорожденных мальчиков и в 85 % случаев протекают в тяжелой или средней формах. Высокая частота, отсутствие радикальных методов лечения, тяжелая инвалидизация уже с раннего возраста делает весьма актуальными поиски эффективных путей диагностики и профилактики этих социально-значимых наследственных заболеваний.
Современные клинико-биохимические и иммунологические методы определения уровня и активности фактора VIII и IX в крови недостаточны для выявления гетерозиготного носительства и совершенно непригодны для пренатальной диагностики гемофилии на ранних сроках беременности. Точная идентификация генов FVIII и IX молекулярно-генетическими методами, их позиционное картирование на генетической карте, клонирование соответствующих кДНК и фрагментов геномных ДНК (Kurachi, Davie, 1982; Jaye et al. 1983; Anson et al.1984; Yoshitake et al. 1983) послужили основой для разработки эффективных молекулярных методов диагностики этих тяжелых наследственных заболеваний.
В настоящее время с этой целью используют два основных подхода: 1) анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ -анализ); 2) прямая идентификация мутаций.
ПДРФ - анализ позволяет на уровне конкретной семьи, точнее конкретного больного определить с каким внутригенным или близлежащим внегенным аллелем полиморфного маркера сцеплен мутантный ген FVIII или FIX, и таким образом осуществить молекулярное маркирование мутантного гена и проследить его передачу в потомстве в данной семье, т.е. уточнить диагностику у больных и выявить скрытых гетерозиготных носителей.
Диагностическая эффективность ПДРФ - анализа определяется широтой спектра аллельных вариантов (диаллельные, полиалельиые системы) и зависит от частоты встречаемости соответствующих аллелей в популяции. Известно, что частоты различных аллелей даже для одного полиморфного сайта могут обнаруживать существенные межпопуляционпые различия. К началу наших исследований по гемофилиям А и В данные о популяционных особенностях вне-и внутригенных полиморфных сайтов генов FVIII и IX у жителей России и стран СНГ отсутствовали. Между тем, только при наличии таких данных и эффективных способов детекции полиморфных аллелей методом ПЦР-анализа можно было разработать эффективную стратегию молекулярной диагностики этих заболеваний. Следует также обратить внимание, что исследования особенностей популяцнонного полиморфизма молекулярных маркеров (аллелей полиморфных сайтов) имеют не только важное прикладное значение для медицинской генетики, но представляют большой самостоятельный интерес для популяционной генетики человека в плане изучения проблем этногенеза и генетической дивергенции популяций, наций и рас.
Несмотря на то, что за последние 10 лет после идентификации обоих генов и анализа их первичных молекулярных последовательностей были зарегистрированы многие сотни мутаций как в гене FVIII (Antonarakis ct а1.,1995),так и в гене FIX (Gianclli et al., 1993), прямой способ молекулярной диагностики этих заболеваний до сих пор не нашел широкого применения. Причины этого- отсутствие мажорных (частых) мутаций и отсутствие выраженных "горячих точек", где происходят типичные поломки, и сравнительно большие размеры гена (FVIII).
Исключением из этого правила оказалась недавно обнаруженная инверсионная мутация интрона 22 гена FVIII, которая была идентифицирована почти у половины всех больных с тяжелой формой гемофилии A (Lakish ct al.,1994). Однако, частота этой мутации в отечественной популяции, ее удельный вес у больных с гемофилией А в России оставались совершенно неизученными. В равной мере, ничего не было известно и о спектре точечных и других мутаций генов FVIII и IX в России и в других странах бывшего СССР. Выяснение этого круга проблем и явилось предметом настоящей диссертационной работы, начатой в 1987г. в Лаборатории пренатальнои диагностики ИАГ РАМН.
Цели и задачи исследования.
Цель: На основе ПДРФ - анализа генов FVIII и IX в различных популяциях и молекулярно-генетического анализа мутаций этих генов у больных гемофилией А и В разработать оптимальные молекулярные способы выявления гетерозиготного носительства и пренатальной диагностики этих заболеваний.
Задачи исследования :
1 Осуществить подбор и оптимизировать работу систем олигопраймеров для анализа Xba I, Hind III, (СА)„ полиморфизмов в гене FVIII, а так же Tag I и Hinfl полиморфизмов в гене FIX.
-
Изучить особенности аллелыюго полиморфизма внутригенных ДНК-сайтов XbaI,HindIII,BglI и (СА)п и внегенмого полиморфного локуса DXS52 (зонд St 14) гена FVIII в различных популяциях жителей России и некоторых стран СНГ.
-
Проанализировать популяционные особенности аллельных вариантов внутригенных ДНК-сайтов TaqI и Hinfl гена FIX .
-
Провести направленный поиск мутаций в гене фактора VIII и IX у больных гемофилией.
5) Изучить частоту и типы инверсионной мутации интрона 22 гена FVIII у больных гемофилией А северо-западного региона России.
6) Отработать оптимальную схему молекулярного обследования семей высокого риска с гемофилией А и В для последующей пренатальной диагностики и выявления гетерозиготного носительства .
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящем исследовании впервые проведена оценка частот аллельных вариантов ряда внутри- и внегенных полиморфных сайтов генов FVIII и FIX в популяции Северо-Западного региона России, узбекской и казахской популяциях; впервые выявлены межпопуляционные особенности аллелыюго полиморфизма этих генов для жителей России и Средней Азии; впервые обнаружены и охарактеризованы новые аллели для двух полиморфных сайтов (DXS52 гена FVIII и Hinfl гена FIX) и показана принципиальная возможность
использования мсжпопуляционных различий в спектре и типах аллелей изученных полиморфных сайтов в геногеографии и этногенезе. Впервые изучены показатели гетерозиготности тестированных полиморфных сайтов генов FVIII и FIX, дана оценка их информативности в различных популяциях России и некоторых стран СНГ, и предложена оптимальная схема молекулярно-генетического анализа в семьях с гемофнлиями А и В. Используя данный подход впервые в СССР и в России осуществлены молекулярно -генетический анализ гетерозиготного носительства и пренатальная диагностика в семьях высокого риска с гемофилией А и В (всего 240 семей). Впервые в отечественной популяции осуществлено тестирование инверсионной мутации нитрона 22 у больных тяжелой формой гемофилии А, установлена высокая частота (45%) этой мутации, т.е. доказана ее большое диагностическое значение для жителей Северо-западного региона России, проведена количественная оценка различных подтипов этой мутации. Впервые у больных гемофилией России предпринят направленный поиск мутаций в гене FVII1, обнаружены две крупные делеции и идентифицированы пять точковых мутаций, две из которых найдены впервые.
Апробация работы.
Представленные в диссертации результаты докладывались на Всесоюзных и Международных симпозиумах и конференциях: па XIX научной сессии, посвященной памяти профессора Д.О.Отто (1990г.), Международной конференции педиатров породненных городов (Одесса 1990г.), Всесоюзных конференциях" Геном человека" (1990 и 1991гг. Персславль-Залесский), II Всесоюзном Съезде медицинских генетиков (1990г. Алма-Ата), па I Российском Съезде медицинских генетиков (1994г. Москва), на XY Конгрессе Международного Общества по тромбозу и гемостазу (1995г. Иерусалим).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано одиннадцать работ.
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 112 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 7 таблицами и 12 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов. Список цитируемой литературы содержит 90 источников.
Работа проводилась в лаборатории пренаталыюй диагностики Института акушерства и гинекологии РАМН под руководством доктора медицинских наук профессора В.С.Баранова и доктора медицинских наук Л.П.Папаян.