Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. КЛАССИФИКАЦИЯГЛИК03ИЛГИДР0ЛАЗ 8
2.2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ16 СЕМЕЙСТВА
ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ 12
-
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДО-13-B-D- ГЛЮКАНАЗ 16 СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ... 15
-
СТРУКТУРА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ 16 СЕМЕЙСТВА 20
-
КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ 28
-
ЭНДО-1,3- В -D-ГЛЮКАНАЗЫДВУСТВОРЧАТЫХ
МОЛЛЮСКОВ 33
-
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
-
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 50
4.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
ЭНДО-1,3-В-В-ГЛЮКАНАЗДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ 50
4.2. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭНДО-1,3-В -D-ГЛЮКАНАЗ
16 СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ 69
4.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ЭНДО-1,3-В^ГЛЮКАНАЗ ДВУСТВОРЧАТЫХ
МОЛЛЮСКОВ 73
4.4. ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЭНДО-1,3-P-D- ГЛЮКАНАЗ
ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ 90
-
ВЫВОДЫ 94
-
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 96
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
1,3-(М)-глюканазы (ЕС 3.2.1.39) относятся к О-гликозилгидролазам, ключевым ферментам метаболизма углеводов. Они расщепляют (3-1,3-гликозидные связи в P-D-глюканах. Эти ферменты широко распространены среди представителей всех царств живой природы, от архебактерий до эукариот, и вовлечены в разнообразные физиологические процессы (Mackay et al., 1985). В частности, 1,3-|3-0-глюканазы бактерий расщепляют 1,3-p-D глюканы клеточных стенок грибов (Wanabe et al., 1992) и ламинараны бурых водорослей (Krah et al., 1998; Dakhova et al., 1993), используемые бактериями в качестве источника глюкозы. В грибах эти ферменты участвуют в расщеплении внеклеточного матрикса при пролиферации клеток, в формировании клеточной стенки, в процессах почкования и споруляции (Pitson et al., 1993). В растениях l,3-(3-D-глюканазы вовлечены в процессы клеточной дифференциации, деградации 1,3-0-D-глюканов при прорастании семян и при оплодотворении, а также являются частью механизма защиты растений от патогенных грибов (Jutidamrongphan et al., 1991; Grenier et al., 1993). Эндо-1,3-рЧ)-глюканазы беспозвоночных животных расщепляют ламинаран (Sova et al., 1970) и клеточные стенки грибов (Kikuchi et al., 2005) в процессе пищеварения, а также участвуют в эмбриогенезе (Bachmanetal.,1996).
На сегодняшний день изучены свойства, клонированы гены и определены аминокислотные последовательности 1,3-рЧ>глюканаз бактерий, грибов и растений, в то время как данные о структуре 1,3-р-0-глюканаз животных крайне скудны. К настоящему моменту определены первичные структуры 1,3-P-D-глюканаз из яйцеклеток морского ежа Stronylocentrotus purpuratus (Bachman et al.,1996) и из нематод Bursaphelenchns xylophilus и Bursaphelenchm mucronatus (Kikuchi et al., 2005). Вместе с тем было показано, что многие виды морских беспозвоночных, особенно двустворчатые моллюски, являются источниками высокоактивных эндо-1,3-р -D-глюканаз (Sova et al., 1970). К настоящему времени достаточно глубоко изучены физико-химические свойства эндо-1,3-Р-Б-глюканаз некоторых видов двустворчатых моллюсков, таких как Spisula sachalinensis, Chlamys albidus и Mizuhopecten yessoensis, накоплены данные по
6специфичности и механизму действия этих ферментов, определены аминокислотные остатки, имеющие существенное значение для активности эндо- l,3-P-D-niK>KaHa3 двустворчатых моллюсков (Звягинцева и Елякова, 1994). Особый практический интерес представляет получение с помощью эндо-1,3-Р-0- глюканаз двустворчатых моллюсков S.sachalinensis и C.albidus 1,3- и l,3;l,6-p~D- глюкоолигосахаридов, гликозидов и биологически активных 1,3-Р-В-глюканов, оказывающих иммуномодулирующее действие на организмы животных и растений (Звягинцева и др., 1995). Поэтому для более детального изучения эндо- l,3-P-D-nnoKaHa3 двустворчатых моллюсков становится актуальным установление их структуры, что необходимо для более глубокого понимания функционирования, происхождения и эволюции этой группы ферментов. Установление первичной структуры эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков также создаст необходимую основу для работы по получению ферментативно активных рекомбинантиых эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков с целью более детального исследования функциональной роли различных аминокислотных остатков в каталитическом процессе методами направленного мутагенеза, а также возможного использования этих рекомбинзнтных ферментов для биотехнологического производства иммуномодулирующих препаратов нового поколения.
Таким образом, глубокое изучение физико-химических свойств и механизма действия эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков и отсутствие информации о структуре этих ферментов определили цель данной работы -установление и анализ структуры эндо-1,3-Р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков.
В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Установить полные нуклеотидные последовательности кДНК и определить аминокислотные последовательности эндо-1,3-р-0-глюканаз двустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis, Mizuhopecten yessoensis, Chlamys albidus и Chlamys rosealbus.
2. Провести филогенетический анализ эндо-1,3-Р-0-глюканаз на основе уже имеющихся в базах данных и полученных нами аминокислотных последовательностей этих ферментов.
3. Построить теоретические модели пространственных структур эндо-1,3-0-D-глюканаз двустворчатых моллюсков с целью исследования структурно-функциональных особенностей этих ферментов.
4. Исследовать возможность гетерологической экспрессии эндо-1,3-р-Б-глюканаз двустворчатых моллюсков в клетках Escherichia coli.
