Введение к работе
\
» ,, ;_: і .-"~ -"""' АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Важнейшей задачей в аспекте охраны
биосферы является определение роли растений в круговороте ксенобиотиков и продуктов их превращения. Установление молекулярных основ дётоксикации ксенобиотиков мембргнносвязанными ферментами, выявление эндогенных и экзогенных факторов, осуществляющих регуляцию их превращения, установление особенностей молекулярных и цитохимических механизмов метаболизма гидрофильных и гидрофобных ксенобиотиков, моделирование детоксицирующих систем, стабилизация ферментных активностей путем иммобилизации целых кикросом или отдельных компонентов гидрохсилируюцей системы, нахоядение простого производного гема, сходного по свойствам с цитохромом Р-450 - вот далеко неполный перечень актуальных вопросов современной ксенобиохимии.
В настоящее время'считается, что гидроксилирование является скоростьлимитирующей стадией полного процесса детоксикании, так как от этого акта зависит рост полярности и соответственно водорастворимости гидрофобной молекулы ксенобиотика. Гидроксилирование ксенобиотиков позволяет эффективнее осуществить их дальнейшее окисление оксидазами, функционирующими преимущественно в водной фазе.
Еще в 1958 г. в печени животных был обнаруяен пигмент, который при восстановлении HADPH или дитионитом в СО-связанном состоянии проявлял интенсивное поглощение с максимумом при 450 ни (Carfinkel, 1958; Klineenberg, 1958). На основе экспериментальных данньс. Гарфинкелем предложена схема цепи свободного <несопряженного с фоофорилированием) транспорта электронов, основными компонентами которой являются цитохром Ь,- -. редуктаза,
иитохром bg и акцептор (или предшественник акцептора) элоктронов. Данная цепь локализована яа мембранах эндоплазматического ретикулума. В дальнейшем данный пигмент, который характеризуется гемопротеидной природой условно был назван "цитохромом Р-450" (Onura, Sato.,1962,1584, 1Є64).
Изучение микросомальных цитохромов в растениях связано с открытием цианидреэистентного дыхания. Был найден гемсодержащий протеин, который Принадлежит к цитохромам группы "Ь" и способен образовывать келеэокислородный комплекс. Наподобие животных, этот пигмент оказался нечувствительным к цианиду и азиду. (Hartin., Morton., 1955).
В каталитических реакциях, осуществляемых монооксигеназным комплексом, цитохром P-45U взаимодействует с субстратом, молекулярным кислородом, получает электроны от соответствующих доноров и, таким образом, функционирует как "активный центр" комплекса.
I» последние годы значительно возросло число работ, посвященных действию монооксигенаэах в растениях. Несмотря на достигнутые успехи, многое остается неясным в функционировании этого комплекса ферментов, впявлениэ которых позволило бы глубае представить молекулярные механизмы детоксикации ксенобиотиков и выявить конкретные возможности их практического применения.
ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Исходя из всего вышесказанного, і абота посвяи;ена исследованию следующего круге задач, которые дпя растительных организмов являются практически неизученными:
1.Установить структурную организацию растительной редокс-tjfi-.и, солерхг щей цитохром Р-450, распределение в клетке моноокс-т'5наэ»юй активности и возможность en индукции.
2.Виявить возможность реализации редуцирующих эквивглечтов НАЬРН л конооксисеяаэных и оксидаэных реакциях.
3. Усанозить взаимосвязь у е.чаду гидроксилированпем
КСЄНОбИОТГКОЬ К ПереКИСНЫМ ОКИСЛОНИСМ МемСргнкЦХ ЛРПИДОВ.
-
Докара і'ь существование/ нитохондриального контроля на микросолальноо окисление ксенобиотиков, т.е. ВОЗМСЗ.ІОСТЬ мигьми.л рєдуцируюиіих эквивалентов с циточромоксидазной системи на микросо. іальну» редэкс-цепь.
-
Показать возможность переключения питохрома Р-4 50 с "ендогенного" на "экзогенный" оежпм р&боты, т.е. переход гемопротеидэ о биосьнтетич«эсчого на яетокс-икащюнный путь.
-
Выявить особенности моноокситчзннроЕ'аьия ксенобиотиков разных типов в растениях.
7 v Установить способность раститрлькой ::леткн гідроксилирешать холестерол, с целью установления локализации стероид-гидроксилк-ру.эщей активности и фактори, влияющие ка этот процесс.
ь. Определчть роль мояооксигеназной системы і- защита метаболических путей, в частности, синтеза белков и РНК ст повреждающего действия ксенобиотиков.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Научная новизна работы,заключается з проведении систематического экспериментального и теоретического анализа растительных мсноокс^-еьазккх систем, .їх гидроксилируюшвй способности и функциональной связи с энергетическими и лласти<:эскими процессами клетки.
Наиболее нахными экспериментальными . результатами работы являютсл следуюкиа:
- я мчкросомальной фракции из корней едчолотных гашений показана вовмозьость иядукпии юрсокекгеааэной систины при
-.. в -
пиэдьаригвлсном выращивании растений на ксанобистиксодерхащей среде;
- в хлоропластах, митохондриях и цИтозсле впервые обнаружена
способность окисления ксенобиотиков, згвисимая от HADPH и
молекулярного кислорода. Данная активность снижается в зависимости
от возраста листьев растений;
- выявлено сходство Структурной организации и функционирования
мйчросохалыюй монэохсигэнаэиой системы растений к ыивотыых; ,
обнаружено, чт- растительная монооксигенагная система осуществляет свсОодяоэ окисление RADPH. При недостатке кислорода и отсутствии cyfT-страта гудроксмльрования происходит обратное восстановления фонда никотнншидаого кофермента;
- в микросомальвых мембранам изучено перекиснос окисление
липидор (ПОЛ). Предпринята попытка установить Еэаимосвяэь ' и
взаимовлияние. ПОЛ и гидроксилировэния ксенобиотиков при их
эдновое менном протекании;
на основе обобщения собстЕгнных и литературных данных проведен сравнительный анализ микросомальаого окисления ксоьоЗиоткксв равной химической природы з растениях. Выявлена пр.імая зависимость между степенью гидрофобности и скоростью окисчеиия ксенобиотиков;
- «юрвке показана способность растительной ткани расщеплять
циклический компонент кслекулы холзстерола, установлено, что
гищэоксилирован^е данного с-ерола происходит по нонооксигеиаэпому
механізму и осуіцоствляется г митохондриях;
лычвлен значительный ингибкрующий -эффект ксьнооиотиков на 'зелок- її РНК- сичт«ззиру»мУ1э а'ітииюсть растительной клетки. В присуі ствии KADPrf ингиЗиропании полное "-ыэ или существенно tiOH"aa.vrc»'. Покатано, что предвари-є-іьно^ Еыр?щивани>э расчрний с
ксенобиотиками способствует индукции моносксигеназ и уменьшению их ингибируичієго действия.
I ПРАКУИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЗДСВАШ1Я. С учащем мс-щнчсїи
мснооксиген&г.-юй активности растений становится возмсчыач строго
ллмитирэвать дозы применяемы:: d сельском ?;солЯетое орглшнчес.гііл
ядов (гсгрСицидоь, фунгицидов, инсектипидоп и др.). Установить для
того ил?? иного вида растений ксяігл часть кеегюбиотика превращается
ь хгрзктерї-'из ироиэжугочиие предухть; клеточного обмена и клкх,л
мокет быть ь дальнейшей судьба кепр&ррашенной чэс-r.i ксенобиотик*
свойства. Определение ионпоксигеназной ак-лівгіости может ст
одним из вахьых критериев длд набора рас^еді.й при планироьакиї
озалененля населенні:* п/нктоо.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Рэзуль'.гты работы даложэлч на научнои сессии института еисхим^и растений АН ГССР (Тбилиси, 1874); Республиканской ваучлой конференции по вопросам е-иохимии сельскохозяйственных растений (Тбилиси, 1876); Республиканской научной конференцій ио вопросам физиологии и Зігохимии раслвнш'і (Тбилиси - 1879, 1Э80, 1987); IV Всесоюзном биохимическом съезда (Москва, 1В79); научной сессии по превращению хими-кьеких загрязнителей биосфера в растеьиях (Тбилиси, 1BSb); Республиканской научной конференции по энзимологии (Тбилиси, 19В1); 'Л IV екегодноґі конференции Европейского общвстьа по мутагекак Енедней ср«=да ч'Нэеквя. i8?4); научной сос;:ии по актуальным Bonpctin 6no»cimi и / биотехнологии (Тбил.іеи, }0ВГ>;; Йсесоязной хоьлгрзиці::» по шітохрсм> Р-453 *и охргяа вьутг^ят-сй среды ч&ловэка (Плімао, 19Є6); V Всесіжігрп ^схю'м'и-'сл^н сілл"^
- є -
(Чоиквг, 1Є86); ТІ республиканской конференции на тєуу: "Проблемы экологической биофиьики" (Тбилиси, 1986); Всесоюзной конференции цитолром Р-450 и охрана окружающей среды (Новосибирск. л987); VI межуниверситетской коьфоречции на тему- "Биологические мембрана и норма и патологии" (Тбилиси, 1.989>; V Езесоюзноь конференции "Питохроп Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 128*)): VII Коудунаро.цьой конференции: "биохимия, бчофи&ина аитохрома Р-450: структура,- функция, биотехнология, экологические аспекты" (Москва, 1991).
Основнме результаты проведенных исследований отражены в 3ti публикациях.
Экспериментальная чг.сть работы е основном віліолнвна на одно- и многолетни.: сельскохозяйственных к. пьтурах, а также травах, к/стаонинах и древесных породах. Опыты проводилась на тонких срезах, гомогенатах и субклеточных фракциях. Сракцик*
.шкрозомэпьчых мембран полуда"» <4С при 3 05.10 й после осаждения
фргкцми ядер (POOg) хлоропластсв <3.i0 g) и митохондрий (17.10 g).
Реакционной срэдой служил 1/15М фосфатный буфер рН-7,4.
Использованные в исследованиях ивто-н описаны в публикациях.
Идентификацию компонентов монооксигенаэной систеъы мик;х>сомзльной фракции проводили спектрально (Свига,Sato. , 39Є4)-. Гидроксилпрованиэ (N- и O-дєметилирсиание) ряда субстратов о\ьниізли по копі-честву .обраговавиегеся формальд-эгида. О г.ерокисноп окисление лигіидов судили по количеству генерированного малонового диальцегида (Свальная и др.,1977), и по степени окисление липіідои ;Барсуков 1< др., 1982).
Полярографические иесгедорчні*я проводили н<-. бисэн<гг--"Цигсми" (разработан в С'Ш АН Респуплчки Грузия в еотргдии'К-ич . Институтом биохимии растений), используя ячейку oTkpmoto ги (объемом 1-Ь ІЛ), снабЖ5ін;>ю «ембралним (для измерения РО,, и рН электподом. Оюрость подзчн кислороде ко.ітролироузлзої пеоемс-аи ваниеы.
При изучении сьобо.чного ОХИСЛсЭЫШ I1ADPH ПОЛЮО.^ІЛИСЬ КОЖ'ИНІІ рованЯиїм методом по-.прографим и сп.зктрсфотсметрпи, применяя кислородный Э.1 ЄКТРОД, ПОГрухеНгІЬПІ Ь ОПТИЧеСКУЮ KJ0BOT/, ОДНГ НГЧІКЄЧЇЮ
устанавливая количественное измечение кофермент? и О0.