Введение к работе
Актуальность проблеми. Одной из наиболее важшх о четен активного транспорта нопеп и метаболитов через плазматические мембрани кивотнмх плеток является на-нпсос, который рассматривает как один «з эшлвцтюнно перпичинх способов осмогсгуляцпн в клетке (Іолдцрев, 1970). В холе эволюции по ыеро усложнения организмов этот, "однажды найденный фундаментальний принцип" (Сент-Дьо-рди), стал использолр.тьст для Функционирования болоо сложных биологических систем, как биохімических, тпкихкая вторнчнмп иг.-за-висиїши активний транспорт нотаболитов, регуляция клеточного цикла, так и физиологических - обеспечение генерации электрическо-го потенциала и проявление возбуждения по нервному и мышечному волокнам, поддержания полно-золотого баланса в многоклеточных организмах (Болдырев, I9S5; leohene, 1988).
Новая ора в изучении молекулярних принципов Функционирования Na-насоса началась более 30 лот тону назад после открития ft. Скоу (skou ,1957) Иа,К-АТ5азы. Било доказано, что этот фермент является молекулярным эквивалентом Ma-насоса: он осуществляет активны]! ьиброс из клетки ионов натрия и "закачку" гг клетку ионов калия против градиентов их концентрация, используя для этого метаболическую оперто, запасенную в вид о АТ5. За истекшее после открытия йа,К-АТазы время усилиями много численних учених были подробно изучена молекулярные свойства фермента, определен его субъединичныи состав, расшифрована первичная, вторичлая» третичная и четвертичная структури, предложены модели трансмембранной упаковки и функционирования На,К-АТФази. Было установлено, что лля нормальной работа фермента требуется определенное лшидное окружение ферментного комплекса..
Согласно развиваемой в. последние годи A.M.Тголевым (Уголев, 1905, 1989, 1990) концепции о блоковом-принципе организации и. эволюции биологических систем, различные физиологические функции клеток складываются из элементарных функций, реализуемых универсальными функциональными блокями (УФБ), которые представляет собой молекулы и надмолекулярные комплекси. А.М.Уголев рассматривает ма.К-АТЗазу как блок 2-го порядка, а плазматическую мембрану, в состав которой входит этот ферментный блок,как комбинированный блок более высокого' порядка, причем функционирование мембраны оп-
- Ц -
ределяетсл ьаатіссвязанной работой ее элементарных блоков. В атом плане иоопедования'оообеиноокеи функционирования иа,К-АТ#~ азы целенаправленно не проводилось.
Кроме того, в последние годы, в овязи о открытием эндоген
ных дигоксин-подобных ингибиторов (ДМ) їіа,К~АТ*азц в организме
вцсшнх животных, содержание которых увеличивается при ряде (физи
ологических и патойогических состояниях, отано ваоказиваться мне
ние ( Schwartz et а1.,'Ш5і Aimer, 1S85 ), что На,К-АТ$аза
иокет выполнять рецепторну» фуикцио в плазматической мембране и,'
таким образом, ыожег осуществляться гуморальная регуняция работы
иа-наооса. .По-видимому, это, в первую очередь, важно для Ив,К-
АТФазц почек, ответственной за реабоорбции натрия в канальцая и,
следовательно, поддержание водно-оолевого гомеостаза в организ
ме. Представления о рецепторно» функции На,К-АТФаэц дают допол
нительное оонование предположить, что работа фермента, как тран
спортного бяока, тесно овязана о функционированием других УФБ
плазматической .мембраны. ' ' - .
бпедуег отметить, что имеются отдельные работы, свидетекъот*
вунмве о тесной пространственной и функциональной взаимосвязи .
Иа,К-АТ$азы о анионтранспортируюцей системой бейка полобы 3
(jfoseal, Solomon ,1983', Janoahaai, Solomon ,1989), с якорным бе
лком анкиринон (nelson, Veataock ,1987; Korsow et el. ,1989),
о мембраноовязанными rликолнтичеокими ферментами (ггоувгы'о, Ко—
fftaaa., 1977; Mercer,. Dunhum. , І90і)в тенях безъядерных эритро
цитов. Показано такке изменение чувствительности фермента к спе
цифическому ингибитору уабадау после удаления ряда периферичес
ких белков с внутренней стороны мембраны ( Lelievre ot al. »
1977, 1983; Charlemagne et al, ,1980)./
Таким образом, походя из сказанного вшив, возникает ряд во
просов, имеющих, на наш взгляд, важное теоретическое значение.
Среди них, в частности, следующие-: имеют пи -структурние белки
плазматической мембраны и, в том числе белки цитоскепзта, окру-
жавиие цитопиазматический .домен 1{а,К-АТ#азного комплекса, влия
ние на работу фермента и, если да, то важна ви зга связь для ре-
цепторной функции ва,К-АТ*а'зн; какую роль играют ДІЙ в поддер
жании В0ДН0-СОЛ9ЮГ0 баланса в организме и какие механизмы обе
спечивают этот гомеоотаэ, ..
В овоей работе ми попыталиоь ответить на оти вопросы, Дня
этого, прежде Eoeru, било н'еобхолімо определить стратегии исследовании, найти адекватные методические н ястодологичєские подходы. Важно также било вибрать подходяиий объект исаледовшшя. В результате анализа литературных динних ми прими к виводу, что, несмотря на относителіно низкую и трудновыяЕляомуо активность
ыаД-АТФазы с ненброне безъядерных эритроцитов млекопитающих, этот объект является наиболее подходящим препаратом плазматической мембраны для подобного рода исследовании. Это обусловлено, прожде всего, тем, <ло оритроцитарнне момбраиы могут быть легко получены без примесей других клеточных мембран и, кроме того, в последние годы достигнут значительный прогресо в изучении структурной организации периферических и интегральных белков эрнтро-цитарной мембраны ( cratzer Д98І; Cooiman, ahiffer ,1933;
Lost ,1986; Beftnett ,J985, 1909). Направление наших ис-
следований складывалось постепенно в ходе собственной работы и по мере накопления новых литературных данных и, в конечном итоге, цели и задачи были сформулированы следующим образом.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования явилось вменение роли структурных белков плазматической мембраны эритроцитов в функционировании ыаД-АТФазы. В связи о этим били поставлены олодувщие задачи:
-
Выяснить оптимальные условия и механизм выявления активности ЫаД-АТФазы в целых эритроцитах и в мембранных препаратах эритроцитов (тенях) с использованием мембранотропннх агентов о разным механизмом действия на биологические мембраны* (ионные и неионные детергенты, хелаторы).
-
Провести сравнительное исследование активности НаД-АТФ-аэы и" особенностей ее выявления в ядерных и безъядерных оритрр-т цитах и в их мембранных препаратах (тенях) в ряду позвоночных и оопоставигь свойства фермента с полипептидным ооотавом плазматических мембран этих клеток.'
3. Исоледовать влияние белков цитоскелета (мембранного скеле
та) безъядерных эритроцитов на активность и свойства ИаД-АТФ-
азы. , , .;
Другой целью работы было изучение особенностей функциокиро--вания ЫаД-АТФазы при некогорых патологичеоких и физиологических состояниях, сопровождающихся изменением водно-солевого балан-
с&. Б атом плане били поставлена следующие задачи:
I. Исследовать изменение активности и свойств ыа.К-АТФазц в еритроцитах и тенях зритроцитов больных первичной артериальной гипертензней (гипертоническая болезнь), а также в эритроцитах, тенях и почках спонтанно гипертонзивнцх крыс линии shk .
Н, Провести аналогичное исследование у животных при адаптации' к шсотиой гипоксии, сопровождающейся, как известно, сдвигами в водно-солевом равновесии.
В данной чаоти работы предполагалось получить новые данные, которие позволили би углубить представления о возможных механизмах развития первичной артериальной гипертенэии у человека и экспериментальных животных,
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение влияния различных по структуре и заряду детергентов на активность и а, К-АТФазы эритроцитов и тоней зритроцитов различных представителей млекопитающих и рыб. Полученные данные позволяет сделать вывод, что в безгядерных эритроцитах-и их тенях активация ыа,К-АТ$азц под действием детергентов происходит за о чет увеличения проницаемости мембран для низ комо леку лярішх веществ, в.результате чего открывается свободный доступ АТФ и эффекторов внутрь клеток.
Наиболее полную активность Ка,К-АТФазы в безъядерных эритроцитах и их тенях можно виявить in vi-ttd только при одновременном воздействии на клетки детергентов и хелагоров; при этом, активирующее действие детергента реализуетоя.о внешней стороны _ мембраны, а хелатора - о внутренней и, очевидно, связано с дезинтегрирующий влиянием на мембранный скелет, который экранирует активные центра фермента.
. В ядерных эритроцитах пресноводных рыб активность ыа,К-АТ$-азы была в несколько раз выше, чем в безъядерных эритроцитах, большинства млекопитающих, и,выявлялась без применения детергентов, которые инактивировали ферментативнув активность. В изолированных мембранных препарага'х ядерных эритроцитов активность Ца,К-АТазы практически не выявлялась.
Впервые продемонстрировано, что'удаление белков мембранного окелета из мембран безгядерных эритроцитов приводит к снижении активнооти и изменении) кинетических свойств Ца,К~дТФазы, а также
других мембранних ферментов (Са-АТ$аза, ацетилхолинэстораза), а обратное связывание спектрина о мембраной сопровождается реактивацией ферментов. Это является доказательством того, что для оптимальной работы ферментов важно не только состояние пипндкой фаза мембрани, но необходима также иотвктиость периферических болков, образупиих мембранний еколог.
Btieprae при первичной артериальной гипертензии у человека
я спонтанно гипертенэивннх крис виявлено снижение активности
йа,К~АТ$азы в целях эритроцитах без изменения ее в отмитих от
внутриклеточного содержимого тенях эритроцитов и пониженная чу
вствительность фермента в целых эритроцитах «"высоким концент
рациям Mg . Полученные данние свидетельствует о наличии в ери
троцитах больных людей и животных факторов, шггибирукщнх актив
ность на,К~АТ*азн и нарушающих кооперативное взаимодействие
субъеднниц фермента. Кроме того, у крыс линии Sim , а в некото
рых сериях опытов и у крыс линии ГО: выявлена более низкая по
сравнению о крысами Вистар активность Na.K-ATS'asu.B почках
(особенно в корковом вещество), что/ по нашему мнению, мокет
являться фактором, предрасполагающим к развитие повняенного АД
у животных. . . .
Научно-практическая значимость работы. Обнаруженный феномен
влияния структурных белков плазматической мембраны эритроцитов,
образующих мембранный окелет, на функционирование На.К-АТФазы
свидетельствует о связи работы інтегральних ферментов мембрани
о ее структурными элементами. Полученные данные имеат'общебио
логическое значение и расширяет напи представления о структурно-
функциональных связях в биологических мембранах; ото позволяет '
развить новое направление по изучению роли мембранного скелета,
плазматических мембран в функционировании транспортных и фермен
тных У$Б мембраны. ' _
На основании данных исследования влияния меибранотропных веществ на активность транспортных АТ1Заэ в эритроцитах разработаны относительно простые методы выявления наиболее полной активности ферментов в целых эритроцитах и их тенях, причем сравнительное определение активности в этих двух объектах позволяет о удить о наличии эндогенных-модуляторов иа,К-АТ$азы в целых эритроцитах, что важно при исследовании крови больных с нарушениями войн о-с о л обо го обмена. Эти методические подходы позволили разра-.'
- a -
ботать "Способ дифференциальной диагностики почечных заболеваний, сопровождающихся гематурией". (Заявка № 4ч9Э135; метод признан изобретением I7.IO.B9). Разработанные нами методы определения активности иа,К-АТ#аэц в целых эритроцитах и тенях применяются в ряде научнцх и медицинских учрездений.
Основнио положения, виносимие на защиту.
-
Исследован механизм активирующего действия детергентов и хвиаторов двухваиентішх катионов на Na.K-АТФазу целых эритроцитов и мембранных препаратов эритроцитов. На основании по яу чек mix данних предложена методы для выявления наиболее полной активности ферментов.
-
Показано качественное аходотво. белкового оостава плазматических мембран безъядерных я ядерних эритроцитов. Выявленные различия в соотношении периферических и интегральных белков определяют механичеокую прочность клеток и проницаемость для растворен-ных^веществ и показывай связь выявляемой активности Л а,К-АТФ-азы о особенностями полипептидного состава;
-
Мембранний скелет эритроцитов млекопитающих являетоя структурой, через которую осуществляется модулирующее (регулирующее) действие внутриклеточных АТФ и Са + на активность транспортных. АТФаз. Выдвинута гипотеза возможного включения белков мембранног го скелета в частние реакции 11а,К-АТ$ааного цикла.
>і. На основании вкязленных различий, в изменении активности и свойств Ка.К-АТФ&зы в эритроцитах и тенях у разных групп больных первичной артериальной гипертензией по- сравнению о нормоген-зивними-лицами представляется, что первичная артериальная гипер-тензия у человека ио является-однородным заболеванием о точки зрения участия И а .К-АТФазн' в патогенезе данной патологии.
5. У большинства больных первичной артериальной гипертензией и у спонтанно гипертенэивных крыс обнаружено-присутствие в. эрит» роцитах эндогенного кнгибіітора на,К-АТ$азы. У крысГ линии знд , отсутствие прогрессивного повышения активности ка,К~АТазы в корковом веществе почек в ходе постнатапьного онтогенеза расома* триваетоя как. фактор,- предрасполагавший к повышению .артеркаиыии» го даваения.
Апробация диссертации. Результаты райогы докладывались на:
_ q -
ІУ-ои (Ленинград, 1979) и У-он (Киев, 198б) Биохимических съездах; УГІ, У!!! и ЇХ Всееоозіда, совещаниях по эволюционной физиологии (Ленинград. 1970, ISCE, 1986); УЇВ. Х-Ш Всесоюзных совещаниях по транспортним АТФаэаи (Тарту, 1900; Алма-Ата, 1983; Ташкент, 1905 ; Иркутск, 1987); Іб-оіі Конференции ?ЗБ0 (Москва, ІРО'О; Кеадународком сишозиумо 'Транспорт ионов и механизмы ого регуляции" (Тбилиси, 1909); Всесоюзном съезде кардиологов (Свердловск, 1903); У Bceoonaiioil конференции по экологической физиологии и биохимии риб (Вильнюс, І9ЯЗ); УІ Конференции биохимиков прибалтийских республик, Белорусской ССР it Ленинграда (Рига, 1981); Всесоюзном совещании "Транспорт газов в тканях при гипоксии" (Нальчик, 1?0б); Воеооюзнон совещании по клинической энэнмолопш (Черновцы, 1989); 8-ой Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевому обмену (Харьков, 1909); Рабочих совещаниях по проблемо "Тонус" (Ленинград, 1987, 1989, 1991); Всесоюзно» симпозиуме "Ионнии транспорт и.регуляция функция клетки" (Ленинград, 1990) и других.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы О глав»)» списания основних методов исследования. экспериментальной части (