Введение к работе
Актуальность темы. Проблема адаптации к изменяющимся условиям внешней среды - одна из центральных в биологии и медицине. Внутриклеточные ферменты не только катализируют превращение эндогенных субстратов, но также служат основными регуляторами обмена веществ (Хочачка, Сомеро, 1988). Каталитические свойства ферментов, в свою очередь, эффективно контролируются концентрацией клеточных метаболитов. Информативным методом исследования каталитической и регуляторнои функции ферментов является изучение кинетики ферментативных реакций.
Среди других тканей организма головной мозг характеризуется высоким уровнем энергетического обмена. Интенсивный окислительный синтез АТР обеспечивает энергией специфические функции нервной ткани. С этим связана характерная для мозга функция ЦТК как, в первую очередь, энергетического механизма (Siesjo, 1978). Для нервной ткани особое значение имеет также реутилизация гликолитического NADH, образующегося в цитоплазме. Перенос Н -эквивалентов внутрь митохондрий обеспечивается шунтовыми транспортными системами, самой мощной среди которых в ткани мозга является малат-аспартатная челночная система (Рэкер, 1967; Скулачев, 1969) . В этой связи большой интерес для изучения представляет митохондриальная NAD-зависимая малатдегидрогеназа (NAD-МДГ), участвующая одновременно в работе ЦТК и малат-аспартатного шунта. Изменение каталитических свойств NAD-МДГ может иметь большое значение в регуляции ЦТК как единой метаболической системы.
Гипоксия является одним из распространенных патогенетических факторов в развитии многих заболеваний. Головной мозг характеризуется высокой чувствительностью к недостатку кислорода. Уже на ранних стадиях гипоксии в нервной ткани определяются специфические биохимические сдвиги, затрагивающие активность ферментов энергетического обмена и стационарные концентрации важнейших метаболитов. В частности, изменяется отношение NAD+/NADH - фактор, контролирующий активность ряда важнейших митохондриальных ферментов (Ещенко, 1982). В этой связи представляет интерес изучение каталитических свойств NAD-зависимой МДТ при переменных концентрациях оксалоацетата и NADH в различных функциональных состояниях организма.
Исследование механизмов регуляции энергетического метаболизма при гипоксии является важным условием для разработки эффективных методов предупреждения и коррекции гипоксических изменений. Для предупреждения метаболических нарушений при гипоксическом стрессе применялось предварительное введение пептида, индуцирующего дельта-сон (ДСИП), как антистрессорного фактора, обладающего адаптогенным действием. Однако влияние ДСИП на обменные процессы в мозге изучено крайне слабо.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение зависимости каталитических свойств митохондриального изофермента NAD-зависимой малатдегидрогеназы мозга от взаимодействия со структурными элементами митохондрий и определение особенностей регуляции при различных функциональных состояниях нервной клетки: в норме, в условиях гипоксического стресса и при введении пептида, индуцирующего дельта-сон, до гипоксии.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. На основании изучения распределения активности NAD-МДГ в
митохондриях и субмитохондриальных фракциях мозга установить
внутримитохондриальную локализацию фермента и дать характеристику
взаимодействия фермента с внутренней мембраной митохондрий.
2. Используя методы стационарной кинетики изучить
каталитические свойства №Ш-МДГ в митохондриях и
субмитохондриальных фракциях мозга. Дать характеристику
зависимости каталитических свойств от взаимодействия со
структурными элементами митохондрий.
-
Изучить зависимость каталитических свойств NAD-МДГ мозга в митохондриях, митохондриальном матриксс и на мембранах от функционального состояния организма.
-
Исследовать особенности регуляции NAD-МДГ в митохондриях и субмитохондриальных фракциях под влиянием пептида, индуцирующего дельта-сон, в условиях гипоксического воздействия.
Научная новизна. Дана количественная характеристика распределения малатдегидрогеназнои активности между матриксом и мембранами митохондрий мозга. Обнаружено, что соотношение активности мембраносвязанного и "растворимого" фермента в норме составляет 3:1.
Охарактеризована "растворимая" форма NAD-МДГ, локализованная в митохондриальном матриксе. Установлено, что данная форма фермента близка по свойствам очищенной NAD-МДГ мозга.
Показана гетерогенность мембранной фракции NAD-МДГ, которая содержит адсорбированный и прочно связанный с мембраной фермент. Активность последнего составляет 15% общей активности NAD-МДГ.
Установлена зависимость каталитических свойств NAD-МДГ от взаимодействия со структурными элементами митохондрий. Показано, что адсорбционные взаимодействия фермента с нативно организованной мембраной ведут к развитию аномального типа кинетики реакции окисления NADH. Выявлена роль ассоциативных (предположительно, белок-белковых) взаимодействий в модификации каталитических свойств NAD-МДГ.
Определены особенности регуляции митохондриальной NAD-МДГ при изменении концентрации NADH. Установлено, что объектом регулирующего воздействия восстановленного кофактора является NAD-МДГ, адсорбированная на митохондриальной мембране.
Дана расширенная характеристика изменений каталитических свойств NAD-МДГ при гипоксическом стрессе, затрагивающих кинетику малатдегидрогеназной реакции в общей митохондриальной и мембранной фракциях. Показана модификация регуляторного влияния NADH в условиях гипоксического стресса.
Изучен механизм антистрессорного действия пептида, индуцирующего дельта-сон. Установлено, что предварительное введение ДСИП предупреждает развитие стресс-индуцированных изменений каталитических свойств NAD-МДГ. При этом кинетические константы малатдегидрогеназной реакции не возвращаются к нормальным величинам, а стабилизируются на промежуточном уровне.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в фундаментальные представления о внутриклеточных механизмах регуляции ферментов на примере митохондриального изофермента NAD-МДГ. Выявленный механизм модификации каталитических свойств NAD-МДГ может служить для понимания роли субклеточных структур в регуляции ферментов.
Изучение изменений каталитических свойств NAD-МДГ в условиях кратковременной гипобэрической гипоксии представляет практический
интерес для понимания механизмов развития метаболических нарушений при данной патологии.
Полученные данные показали результативность ДСИП по отношению к реакциям энергетического обмена в мозге и позволили дать характеристику метаболического эффекта нейропептида при острой гипобарической гипоксии как протекторного, а сам препарат отнести к группе адаптогенов метаболического действия. Данное исследование проводилось в рамках доклинического испытания пептида, индуцирующего дельта-сон, как лекарственного препарата, что приобретает прямое практического значение.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном совещании "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990 г.), 2-й Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991 г.), Симпозиуме стран СНГ "Макро- и микроуровни организации мозга" (Москва, 1992 г.), Российской научной конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы" (С-Петербург, 1994), III International Symposium on Hypoxia (Berlin, 1994), Международной зимней школе молодых ученых по нейрохимии "Новые направления в изучении метаболизма мозга (С-Петербург, 1995 г.) и т.д.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (1-я - обзор литературы), выводов и списка литературы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста (исключая список литературы), содержит 27 таблиц и 48 рисунков. Библиография представлена 235 источниками, из них 55 отечественные.