Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях 8
Аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов 9
Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции 12
Структура фермента 15
Гистерезисное поведение Комплекса 1 23
Возможные способы регулирования фермента in vivo 28
Реакционноспособность SH-групп в белках 30
Методы исследования 38
Препаративные методы 38
Выделение митохондрий сердца быка 38
Получение субмитохондриалъных частиц 39
Получение препарата активированных и деактивированных субмитохондриальных частиц 40
Получение препарата изолированного Комплекса 1 40
Получение препарата митохондрий сердца крысы 41
Получение препарата митохондрий, обработанных аламетицином 42
Подготовка препарата митохондрий к электронной микроскопии 42
Аналитические методы 43
Измерение малат/глутамат-оксидазной реакции и величины дыхательного контроля 43
Измерение NADH:Ql-pedyKma3Hou активности 44
Измерение NADH-оксидазной активности 44
Измерение изоцитратдегидрогеназной активности 45
Измерение аконитазной активности 45
Измерение сукцинат-оксидазной активности 45
Измерение АТРазной активности 46
Изучение набухания митохондрий по изменению светорассеивания 46
Определение белка 46
Результаты и их обсуждение 47
Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий, субмитохондриальных частиц и изолированного Комплекса 1 47
Влияние ионов магния на NADH-оксидазную активность митохондрий 53
Ультраструктура митохондрий сердца крысы, обработанных аламетицином 56
Аконитазная и изоцитратдегидрогеназная активности митохондрий сердца крысы до и после обработки аламетицином 62
Кинетика деактивации Комплекса І в митохондриях и субмитохондриальных частицах 66
Локализация SH-группы, меняющей реакционноспособностъ при деактивации Комплекса I. 69
Общее содержаниереакционноспособных SH-групп в препаратах митохондрий сердца крысы и СМЧ сердца быка 72
Реакционноспособность SH-группы Комплекса 1 74
Выводы 84
Список литературы 86
- Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях
- Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции
- Получение препарата активированных и деактивированных субмитохондриальных частиц
- Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий, субмитохондриальных частиц и изолированного Комплекса 1
Введение к работе
Изучение ферментов внутренней мембраны и матрикса интактных митохондрий сильно осложнено существованием барьеров проницаемости для добавленных извне реагентов (субстратов, ингибиторов, возможных регуляторов). Рассмотрим в качестве примера более или менее распространенный прием оценки ферментативной активности Комплекса I дыхательной цепи по скорости потребления кислорода митохондриями в присутствии субстрата, окисляющегося NAD-зависимой дегидрогеназой цикла Кребса. Измеряемая скорость реакции определяется, по крайней мере, 4 ферментами: специфическим переносчиком субстрата из внешней среды в матрикс, NAD-зависимой дегидрогеназой, Комплексом I и убихинол-оксидазным участком дыхательной цепи. Вклад активности каждого из этих ферментов в измеряемую скорость дыхания чаще всего неизвестен и потребление кислорода в такой системе может служить только качественной оценкой активности Комплекса I, также как и трех других ферментов. Аналогичная ситуация возникает и при измерении активностей других внутримитохондриальных ферментов: Комплекса II (сукцинат: убихинон-оксидоредуктазы), F0FrATPa3bi, дегидрогеназ цикла Кребса. Применительно к ферментам внутренней мембраны митохондрий указанную трудность обычно преодолевают, используя один из следующих методических приемов. Обработка митохондрий ультразвуком приводит к образованию «вывернутых» («inside-out») фрагментов внутренней мембраны митохондрий (так называемые субмитохонлриальные частицы - СМЧ), где активные центры Комплекса I, II и F0FrATPa3bi оказываются доступны для добавленных субстратов. Мембраны можно также разрушить многократным замораживанием и оттаиванием интактных митохондрий. Наконец, использование поверхностно-активных веществ (детергентов) позволяет солюбилизировать мембраны и получить высокоочищенные гомогенно-дисперсные препараты, для которых проблема проницаемости не существует. Перечисленные приемы позволили
сформировать современные представления о структуре и каталитических свойствах компонентов сопрягающей мембраны митохондрий. Следует, однако, иметь в виду, что каталитические и регуляторные свойства этих ферментов в интактных митохондриях могут отличаться от тех, которые хорошо изучены с использованием препарата «вывернутых» СМЧ или очищенных препаратов (вследствие изменения естественного фосфолипидного окружения, потери белков и/или низкомолекулярных компонентов матрикса, специфического, или неспецифического влияния детергентов). В связи с этим представляется актуальным найти способ измерения активности внутримитохондриальных ферментов в интактных митохондриях.
В течение многих лет наша группа занимается изучением каталитических и регуляторных свойств митохондриальной ЫАОН:убихинон-оксидоредуктазы (Комплекс I дыхательной цепи). Один из результатов наших исследований -обнаружение и характеристика необычного свойства фермента: его существование в двух медленно взаимопревращающихся формах (А - активная, D - деактивированная формы фермента). Молекулярный механизм этого превращения (AoD-переход) неизвестен. Переход комплекса в D-форму (каталитически неактивную) сопровождается появлением чувствительности фермента к SH-реагентам. Можно предположить, что реакционноспособная SH-группа (A/D-SH) является мишенью для регуляторного воздействия на фермент природных соединений. В связи с этим установление локализации этой SH-группы Комплекса І в интактных митохондриях (матрикс или межмембранное пространство) - актуальная задача исследования фермента.
Настоящая работа имела две цели: 1) разработать простой способ измерения активности и характеристики свойств Комплекса І в интактных митохондриях; 2) установить локализацию и выяснить реакционноспособность SH-группы одной из форм Комплекса I.
Для достижения первой цели мы изучили влияние порообразующего антибиотика аламетицина на активности внутримитохондриальных ферментов
и показали, что его использование позволяет количественно изучать активность Комплекса І в интактных митохондриях [Gostimskaya, 2003].
Используя аламетицин в качестве инструмента, мы показали, что реакционноспособная SH-группа Комплекса I локализована на матриксной стороне внутренней мембраны митохондрий [Gostimskaya, 2006].
Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях
Способы измерения активности ферментов в шшактпых митохондриях
Разделение процессов клеточного метаболизма по разным органеллам -прогрессивная черта эукариотических организмов. Митохондрии, где происходит окислительное фосфорилирование, представляют собой пример одного из таких достаточно специализированных клеточных образований.
Митохондриальный матрикс окружен двумя мембранами - наружной и внутренней. В наружной мембране имеются поры, способные пропускать соединения с молекулярной массой 10 кДа. Поэтому считают, что состав низкомолекулярных соединений в цитозоле и межмембранном пространстве идентичны. Наружная мембрана окружает многократно превышающую ее по поверхности сильно складчатую внутреннюю мембрану, формирующую осмотический барьер между межмембранным пространством и матриксом. Во внутренней мембране имеются специфические переносчики для множества метаболитов (ATP/ADP-антипортер, фосфатный, ди- и три-карбоксилатный переносчики и др., всего более 30), тогда как для NAD(P)H внутренняя мембрана практически непроницаема. При измерении активности Комплекса I с использованием глутамата и малата в качестве субстратов дыхания помимо исследуемого фермента в процессе участвуют переносчики субстратов, NAD+-зависимая малат-дегидрогеназа, трансаминаза, а также терминальный участок дыхательной цепи. Таким образом, при измерении дыхания митохондрий нельзя быть уверенным, что именно работа Комплекса I является скорость-лимитирующим процессом.
Существуют и другие приемы преодоления непроницаемости внутренней митохондриальной мембраны при измерении активности матриксных и мембранных ферментов: растворение мембран при помощи детергентов, а также разрушение мембранных препаратов под действием осмотического шока, озвучивания или замораживания/оттаивания. Все эти методы делают доступным матриксное содержимое митохондрий, однако, при такой обработке значительно повреждается нативная структура мембран. Следовательно, изменяется локальное окружение ферментов внутренней мембраны митохондрий, что может повлиять на их активность. Помимо этого значительные повреждения структуры мембран могут привести к диссоциации крупных белковых комплексов, особенно примыкающих к мембране или погруженных в нее. Очевидно, что для количественной характеристики ферментов матрикса или внутренней мембраны митохондрий желательно обеспечить свободную проницаемость мембран для субстратов этих ферментов, не разрушая при этом самих мембран. Одним из возможных приемов может быть использование для этой цели каналообразующих веществ.
Аламетищш как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов.
Аламетицин (антибиотик U 22324) - природный продукт жизнедеятельности гриба Trichoderma viride, впервые выделенный в 1967 г. [Reusser, 1967]. Аламетицин - пептид, состоящий из 20 аминокислот: Ас-Меа-Pro-Mea-Ala-Mea-Ala-GIn-Mea-Val-Mea-Gly-Leu-Mea-Pro-Val-Mea-Mea-Glu-(Pheol)-GlnOH, где Меа - ос-метилаланин (=Aib, альфа-аминоизомасляная кислота), Pheol - фенилаланинол (2-амино-3-фенил-1-пропанол) [Martin and Williams, 1976]. Аламетицин относится к семейству пептидов, называемых пептаиболами (peptaibols) из-за большого количества остатков альфа-аминоизомасляной кислоты (Aib) и восстановленного С-конца молекулы (-ол) [Jacob and Cafiso, 1997]. К этому же семейству антибиотиков относятся зервамицин, сузукацилин, трихотоксин и др. [Mathew and Balaram, 1983].
При малых концентрациях аламетицин образует потенциал-зависимые поры в бислойных липидных мембранах. В составе молекулы выделяют а-спиральные участки, которыми богат С-конец молекулы, ответственные за встраивание аламетицина в мембрану. 13 Остатков на N-конце молекулы обеспечивают транспорт ионов и разобщение фосфорилирования в митохондриях [Mathew and Balaram, 1983].
Проводимость канала зависит от концентрации аламетицина, липидного состава мембраны, ее толщины, температуры и величины мембранного потенциала [Vodyanoy et al., 1982]. Каналы, образуемые аламетицином, обладают катионной селективностью, однако пропускают и анионы. Предполагалось, что катионы могут вступать в электро-статические взаимодействия с отрицательным зарядом на С-конце молекулы, что обеспечивает их предпочтительное пропускание. Показано, что замена Glu-18 на Lys приводит к инверсии ион-селективности [Starostin et al., 1999]. Это указывает на участие отрицательного заряда на Glu-18 в катионной селективности аламетицина.
Другими авторами [Kaduk et al., 1998] было показано, что Pro-14 и Gly-11 участвуют в формировании структуры, необходимой для правильной ориентации аламетицина в мембране. Теми же авторами было показано, что Gln-7 стабилизирует а-спиральную структуру за счет образования внутримолекулярных водородных связей.
Различными исследователями были предложены 2 гипотезы о строении аламетицинового канала. Гордон и Хэйдон в 1974 г предположили, что аламетицин образует в мембране поры стандартного диаметра, которые открываются и закрываются статистически. Однако, эта модель впоследствии не получила подтверждения. Большинство накопленных результатов говорит в пользу гипотезы, высказанной примерно в то же время Бауманом и Мюллером и Бохаимом. Их гипотеза строения аламетицинового канала получила название модели «бочонка» («barrel stave model»). По этой гипотезе пора, образованная аламетицином, может увеличиваться в диаметре за счет добавления в нее новых молекул аламетицина. Таким образом, канал собирается из молекул аламетицина, как бочонок из дощечек. Каждому состоянию канала соответствует определенное количество мономеров в кольце. Однако остается неясным механизм встраивания аламетицина в мембрану. По одной из версий мономеры аламетицина сначала пронизывают мембрану насквозь, а затем за счет латеральной диффузии собираются в канал. По другой версии мономеры собираются на поверхности мембраны в агрегаты - предпоры, которые в результате конформационных изменений и образуют ионный канал [Ермишкин, Зильберштейн, 1982].
Аламетицин образует в липидном бислое и биологических мембранах олигомерные каналы с несколькими некратными уровнями проводимости. Отдельный канал всегда включается и выключается через уровень с наименьшей проводимостью и совершает «случайные блуждания по состояниям разной проводимости» [Ермишкин и др., 1988].
Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции
Структура фермента
На сегодняшний день Комплекс I - один из самых больших известных мембранных белковых комплексов. Его «упрощенная» версия - бактериальный фермент (NDH-1) - состоит из 14 субъединиц и имеет молекулярную массу -550 кДа, тогда как митохондриальный Комплекс I состоит из 45 субъединиц ( 1 млн. Да). Гомологи всех субъединиц, а также все кофакторы бактериального фермента присутствуют и в более сложно организованном митохондриальном Комплексе I, структура которого изучена гораздо менее детально. Семь из 14 субъединиц бактериального фермента образуют периферический домен, выступающий в цитоплазму и содержащий в своем составе нековалентно связанный FMN, железо-серные кластеры, а также
NADH-связывающие участки. Остальные 7 субъединиц гидрофобны, образуют 54 трансмембранных а-спирали, и, вероятно, участвуют в процессе транслокации протонов. Аналоги семи гидрофобных бактериальных субъединиц у эукариот (ND1 - ND6 и ND4L) кодируются митохондриальным геномом, тогда как остальные субъединицы - ядерным.
В дополнение к 14 субъединицам, представленным в бактериальном Комплексе I, митохондриальный фермент эукариот содержит еще около 30 «добавочных» субъединиц, кодируемых ядерным геномом. Функция большинства из этих субъединиц до сих пор не выяснена. Одна из субъединиц (SDAP) обладает высокой степенью гомологии с ацил-переносящими белками (АСР - Acyl-Carrier Protein) бактерий и хлоропластов и содержит в своем составе фосфопантотеновую кислоту [Runswick et al, 1991; Sackmann et al., 1991]. Существуют данные о том, что белок SDAP (АСР) принимает участие в синтезе жирных кислот de novo в митохондриальном матриксе [Brody and Mickolajczyk, 1988; Mickolajczyk and Brody, 1990; Zensen et al., 1992; Schneider et al., 1995]. Недавно было показано, что большая часть белка SDAP находится в растворимой фракции внутримитохондриальных белков, а не в составе Комплекса I [Cronan et al., 2005]. Однако это не исключает возможности участия (Комплекс 1)-связанной SDAP во внутримитохондриальном синтезе жирных кислот.
Другая «добавочная» субъединица - В 16.6 - является продуктом гена, отвечающего за апоптоз (белок GRIM 19 - Gene associated with Retinoid Interferon-induced Mortality). Можно предположить, что эта субъединица осуществляет связь между дыхательной цепью митохондрий и сигнальными путями, ведущими к клеточной гибели [Fearnley et al, 2001]. Еще одна субъединица - В 14.7 - обладает гомологией с белками семейства ТІМ, участвующими в переносе полипептидов через внутреннюю мембрану митохондрий. Возможно, эта субъединица участвует во встраивании 13 остальных субъединиц Комплекса I, относящихся к группе В (В8, В9, В12, ВІЗ, В14, В 14.5а, В14.5Ь, В15, В 16.6, В17, В 17.2, В18, В22), кодируемых ядерным геномом, и не имеющих в своем составе сигнальных последовательностей, но имеющим модифицированный N-концевой остаток аминокислоты [Carroll et al., 2002].
Впервые информация о пространственном строении Комплекса I из сердца быка была получена при анализе двухмерных мембранных кристаллов [Boekema et al., 1984]. Исследователи получили картину комплексов из 4-х мономеров, организованных в пару димеров. Однако в дальнейшем выяснилось, что эти тетрамерные кристаллы были сформированы лишь фрагментами Комплекса I дыхательной цепи [Leonard et al., 1987]. Позднее анализ двухмерных мембранных кристаллов препарата из Neurospora crassa привел к выявлению характерной L-образной формы фермента (см. рис. 1) [Hofhaus et al., 1991], которая в дальнейшем воспроизводилась в экспериментах с помощью негативного контрастирования и электронной криомикроскопии препарата.
Каждая из перечисленных методик имеет свои преимущества и недостатки. Например, при анализе изображений, полученных при помощи негативного контрастирования, могут возникать искажения, связанные с неравномерным прокрашиванием и уплощением анализируемых белковых частиц [Friedrich and Bottcher, 2004]. Недавно в группе Фридриха было сделано предположение, что L-образная форма - лишь одна из по меньшей мере двух возможных стабильных конформаций фермента. При низкой ионной силе выделенный препарат фермента из Escherichia coli, а также фермент, реконструированный в липосомы, может принимать форму, напоминающую подкову, где оба домена располагаются «бок о бок», а не под прямым углом. Авторы исследования предполагают, что именно эта, а не L-образная конформация фермента является каталитически активной [Bottcher et al., 2002]. Однако до сих пор большинство исследователей придерживается гипотезы об L-образной структурной организации фермента.
Интересным является тот факт, что митохондриальный и бактериальный ферменты имеют приблизительно одинаковые линейные размеры (см. рис. 1). Бактериальный фермент лишь слегка короче митохондриальиого, несмотря на то, что его молекулярная масса почти в 2 раза меньше. «Добавочные» субъединицы митохондриальиого Комплекса I равномерно распределены по всей поверхности фермента, как бы окружая каталитическую «сердцевину», имеющую высокую степень гомологии с бактериальным ферментом. На некоторых препаратах Комплекса I митохондрий сердца быка видно сильное сужение в мембранном домене, а на некоторых - наличие узкой перемычки между мембранным и периферическим доменами шириной всего 3 нм. Неизвестно, является ли данная черта отображением реальной картины структурной организации комплекса или всего лишь артефактом, возникающим при выделении и окрашивании препарата. [Guenebaut et al., 1998]
Получение препарата активированных и деактивированных субмитохондриальных частиц
Препарат получали по модифицированной методике Джекобуса и Сакса [Jacobus and Saks, 1982]. Сердца двух крыс обсушивали фильтровальной бумагой и ополаскивали трижды в переохлажденной среде выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (7,4) и 0,2 мМ ЭДТА. После этого все процедуры проводились на льду. Сердца измельчали ножницами на чашке Петри 5 мин, после чего продавливали через тканевой пресс. Полученный фарш трижды промывали в среде выделения, каждый раз фильтруя его через капроновый фильтр, до обесцвечивания промывных вод. Затем к суспензии добавляли 10 мл среды выделения и ставили на магнитную мешалку. При постоянном перемешивании добавляли 0,5 мл раствора трипсина, содержавшего 2,5 мг трипсина в 1 мл 1 мМ НС1, и инкубировали в течение 15 мин. На 4-ой и 9-ой минутах суспензию вручную гомогенизировали (гомогенизатор Поттера из органического стекла) и переносили в другой стакан, стоявший на магнитной мешалке. Через 15 мин добавляли 6,5 мг ингибитора трипсина, растворенного в 10 мл среды выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА. Эта же среда использовалась во всех последующих процедурах. Гомогенат перемешивали в течение 1 мин и затем фильтровали через капроновый фильтр. Фильтрат сохраняли, а к оставшейся суспензии добавляли 20 мл среды выделения и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе 1 мин. Гомогенат объединяли с фильтратом и центрифугировали 15 мин при 600 g (2 500 об./мин) в центрифуге «Beckman» (ротор JA-20). Осадок отбрасывали, а супернатант фильтровали через капроновый фильтр. Процедуру промывания полученного препарата проводили трижды. Для этого суспензию центрифугировали 15 мин при 8 500 g (9 000 об./мин) в центрифуге «Beckman» (ротор JA-20), супернатант по возможности полно сливали, а осадок ополаскивали небольшим количеством среды выделения, стараясь удалить белую налет вокруг коричневого осадка. Осадок суспендировали вручную в маленьком гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл среды выделения. Затем суспензию переносили в центрифужный стакан, добавляли среду выделения до объема -20 мл и повторяли процедуру промывки. Во время последней стадии осадок промывали и суспендировали в минимальном количестве среды, не содержавшей БСА (0,4-0,6 мл). После этого отбирали 15-25 мкл суспензии на определение белка по модифицированному биуретовому методу. Суспензию митохондрий во время экспериментов хранили на льду не более 7-8 часов.
Получение препарата митохондрий, обработанных аламетицииом
Суспензию митохондрий сердца крысы, полученных по описанной выше методике, доводили при комнатной температуре до объема 5 мл (0,5 мг белка/мл) средой выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА. Затем добавляли аламетицин и MgCb до конечной концентрации 40 мкг/мл и 2,5 мМ соответственно. Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре, после чего добавляли равный объем охлажденной среды выделения и центрифугировали 15 мин при 15 000 об./мин в центрифуге «Beckman» (ротор JA-20). Осадок суспендировали в минимальном объеме среды выделения, не содержавшей БСА, и отбирали 15 мкл для определения концентрации белка по модифицированному биуретовому методу. Во время опытов суспензию митохондрий хранили на льду.
Подготовка препарата митохондрий к электронной микроскопии
Митохондрии, выделенные из сердец 2-х крыс, суспендировали в 400 мкл среды выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 50 мМ Hepes-KOH (рН 8,0), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА (см. выше). Полученную суспензию разделяли на 2 равные части по 200 мкл, а затем разводили той же средой в 5 раз. Первый препарат был контрольным, а ко второму препарату добавляли аламетицин и раствор MgCl2 до концентраций 40 мкг/мл и 2,5 мМ соответственно. Препараты инкубировали 5 мин при комнатной температуре, после чего в каждую пробу добавляли по 200 мкл 25%-ного глутарового альдегида и инкубировали на льду в течение 30-60 минут. Фиксированные глутаровым альдегидом препараты центрифугировали при 11 000 об./мин в течение 10 мин на настольной центрифуге «Eppendorf». Полученные осадки промывали буфером, содержавшим 0,3 М сахарозу, 50 мМ Hepes-KOH (рН 8,0) и 0,2 мМ ЭДТА. Осадки разделяли тонкой иглой на несколько частей и помещали в раствор, содержавший 1,5 мл осмиевой кислоты и 1,5 мл буфера, на 40 мин. После этого оба препарата несколько раз промывали 50%-ным раствором этанола, чтобы удалить остатки воды. Дальнейшая процедура состояла в постепенном повышении концентрации спирта в пробах. Инкубацию проводили в 50%- и 60%-ном растворах спирта по 30 мин, а затем в растворе уранилацетата, приготовленном на 70%-ном растворе спирта, в течение ночи ( 4С). На следующий день пробы обрабатывали 80%-ным спиртом (30 мин), после чего их оставляли в 96%-ном спирте на ночь при 4-5С.
На следующий день препараты еще раз промывали спиртом, а затем 2 раза ацетоном, каждый раз инкубируя по 20-30 минут. Затем осадки митохондрий последовательно помещали в смолу («Ероп»), разведенную ацетоном в 3, 2 и 1,5 раза соответственно, каждый раз оставляя препараты для пропитки смолой на ночь при комнатной температуре. Последним этапом было помещение препаратов в неразведенную смолу при 37С в течение ночи и дальнейшая полимеризация эпона при 60С до твердого стекловидного состояния.
Ультратонкие срезы фиксированных препаратов, а также электронномикроскопические снимки срезов были сделаны в Отделе электронной микроскопии (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского) Л.Е. Бакеевой.
Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий, субмитохондриальных частиц и изолированного Комплекса 1
Так как внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для NADH [Lehninger, 1951], а NADH-связывающий центр Комплекса I экспонирован в матрикс, выделяемые нами препараты интактных митохондрий сердца крысы (дыхательный контроль 10) практически не окисляют добавленные пиридиннуклеотиды (данные не приведены). В связи с этим нас интересовала возможность использования аламетицина, каналообразующего антибиотика, для увеличения проницаемости внутренней митохондриальной мембраны. Ранее на препарате интактных митохондрий печени крысы было показано, что аламетицин в концентрации около 10 мкг/мл вызывает активацию их сукцинатоксидазной активности [Ritov et al., 1992]. Недавно в нашей лаборатории было показано, что и NADH-оксидазную активность можно измерять с использованием этого антибиотика [Grivennikova et al., 2001].
Мы сравнили зависимости сукцинатоксидазной (рис. 4, кривая 1) и NADH-оксидазной (рис. 4, кривая 2) активностей митохондрий от концентрации добавленного аламетицина. Видно, что максимальная NADH-оксидазная активность фермента выявляется при концентрациях аламетицина, превышающих 20 мкг/мл, а полная активация сукцинатоксидазы происходит уже при добавлении 10 мкг/мл антибиотика, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее Ритовым и соавт. [Ritov et al., 1992]. Так как в митохондриальной мембране существует дикарбоксилатный переносчик, способный переносить сукцинат внутрь, а образованный фумаразой малат наружу, можно считать, что активация окисления сукцината происходит за счет разобщения мембраны (увеличения проницаемости мембраны для протонов). Однако активность сукцинатоксидазы в присутствии аламетицина (0,4 мкмоль/мин/мг белка) в 3 раза выше, чем активность, измеренная в присутствии разобщителя (0,15 мкмоль/мин/мг белка), что указывает на дикарбоксилатный переносчик в качестве лимитирующего фактора при измерении окисления сукцината в полностью разобщенных митохондриях. Таким образом, увеличение активности сукцинатоксидазы при добавлении аламетицина можно объяснить суперпозицией двух процессов: разобщения мембраны и увеличения проницаемости мембраны для субстрата.
Различия в концентрациях аламетицина, необходимых для выявления максимальных активностей NADH- и сукцинат-оксидазной реакций, по-видимому, обусловлено строением аламетициновой поры («модель бочонка») [Ермишкин, Зильберштейн, 1982]. Согласно этой модели при увеличении концентрации аламетицина происходит увеличение диаметра образующегося канала, и следовательно, для проникновения через мембрану более крупный субстрат нуждается в большей концентрации добавляемого аламетицина. 100 OS
Митохондрии сердца крысы (0,3 мг/мл) инкубировали в среде, содержащей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 10 мкМ цитохром с в присутствии 2,5 мМ MgCb и различных количеств аламетицина в течение 5-ти минут. Реакцию начинали внесением 1мМ NADH (кривая 2) или 10 мМ сукцината (кривая /) соответственно. При измерении сукцинат-оксидазной активности среда дополнительно содержала 5 мкМ ротснон. NADH-оксидазную активность регистрировали спектрофотометрически при 380 нм, а сукцинатоксидазную активность определяли полярографически по убыли Ог В табл. 1 представлены сводные данные по влиянию аламетицина на различные оксидоредуктазные активности, измеренные на препаратах митохондрий, СМЧ и выделенного Комплекса I. Скорость глутамат/малат-поддерживаемого дыхания в состоянии 3 (в присутствии ADP и Pj) была в 10 раз ниже, чем скорость окисления NADH после добавления аламетицина (0,13 и 1,25 мкмоль/мин/мг белка соответственно). NADH-оксидазная реакция, измеренная в присутствии аламетицина, была на 90% чувствительна к ротенону и не стимулировалась добавлением разобщителя. Аламетицин не влиял на NADH-оксидазную активность, катализируемую выделенным препаратом Комплекса I и субмитохондриальными частицами. Последнее доказывает, что полученный нами препарат СМЧ действительно являлся препаратом «вывернутых» митохондриальных мембран, где активный центр Комплекса I обращен наружу.
Еще один фермент, активность которого является важнейшей характеристикой препарата митохондрий, - F0Fi-ATPa3a. По меньшей мере, два переносчика могут вносить вклад в скорость гидролиза АТР разобщенными митохондриями, - карбоксиатрактилат-чувствительная ATP/ADP-транслоказа и фосфатный переносчик. Как видно из результатов, представленных в табл. 2, аламетицин делает мембрану проницаемой для ATP, ADP и фосфата, так как в его присутствии реакция становится нечувствительной к добавлению карбоксиатрактилата. Скорость олигомицин-чувствительного гидролиза АТР после добавления аламетицина была в 2 раза выше, чем скорость, измеренная в присутствии разобщителя (1,4 и 0,8 мкмоль АТР/мин/мг белка соответственно). Это указывает на то, что в нативных, необработанных аламетицином митохондриях лимитирующим скорость реакции фактором являются переносчики (нуклеотидный и/или фосфатный). Обработанные аламетицином митохондрии полностью сохраняли чувствительность АТРазы к азиду и олигомицину, специфическим ингибиторам F0FrATPa3. С другой стороны, как и ожидалось, аламетицин не влиял на карбоксиатрактилат-нечувствительную АТРазную активность СМЧ.
Похожие диссертации на NADH: убихинон-оксидоредуктаза митохондрий: аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов и топография реакционноспособных SH-групп комплекса I
