Введение к работе
Актуальность темы. В последнее десятилетие стали складыоаться новые представления об организации метаболизма, связанные с Формированием понятий о надмолекулярной организации Ферментов. Надмолекулярные ферментные комплексы, вероятно, являйтея одним из промежуточных звеньев между ферментами и органеллами в иерархии клеточных структур. В настоящее время ступени молекулярной и надмолекулярной организации метаболизма можно представить таким образом; ферментная субъединица, четвертичная структура ферментов, надмолекулярные ферментные комплексы и конъюгаты, клеточные орглнеллы, клетки, ткани и т.д., каждая с присущей ей системой регуляции. Примеров обнаруженных к настоящему времени надмолекулярных Ферментных комплексов множество. К наиболее изученным из них нужно отнести мультиферментный комплекс Агол у бактерий, пируватдегидрогемазный комплекс и др. Их существование маде.гно установлено как in vitro, так и in vivo. На столь очевидна ситуация при комплексообрг.зовании оодорастооримых Ферментов. Известно, что внутриклеточная кон— і центрация цитоплазматических водорастворимых белков достигает 250—400 мг/мл. При таких высоких концентрациях белки in vitro самопроизвольно агрегирумт. Естественно предположить, что в кгятке цитеплазматичаские балки структурированы и, вероятна, целенаправленно организованы. Предположение о структурно— функциональной организации гликолитических Ферментоз зародилось вслед оа гипотезой о надмолекулярной организации водорастворимых белков. Это неудивительно, поскольку известно, что, во — первых, основную часть водорастворимых белков цитоплазмы < 65Х водорастворимых белков Е. сої і и более 50Х мысечных белкоа> составляет гликолитические ферменты; во-вторых, гликолитические Ферменты, являясь на протяжении многих лат самым популярным объектом о биохимии, изучены весьма обстоятельно. Кроме того, гликолиз, по-видимому, самый консерватизме мэтлболический путь. Это предоставляет возможность широких обобщений для многих видов клеток и тканей при изучении закономерностей его организации в одной органе. Вероятно, в этом отмокгении среди всех других метаболических путей гликолиз уникален. Поэтому многие исследования надмолекулярной органи-аации гликолиза у млекопитамщих были ограничены самым изученным и удобным объектом — ферментами из мышечной ткани. Однако
Использованные сокращения: Е-енолаоа, РГМ-фосфоглицератмутаза, П.Ч—пируваткиназа, ЛАГ-лактатдегидрогеназа, ГК-гексокинаэа, РфК -фосфофруктокиназа, А-альдолаза, ГАРД.-глицеральдегид-3-фасфат— дегидрогеназа, РГК-фосфоглицераткинаэа, ,2-Рг —2-фосфоглицерат, З-Рг -3-фосФоглицерат, Реп -фосфоенолпируоат, ГаР -глицер-альдегид-3-фосфат, Рг-2,3 -2,3-дифосфоглицерат, ФИТЦ -флуорес-цеин изотиоцианат, ИфА —иммунофермемтный анализ
s последние годы в результате исследований гликолиза в ЦНС выявилась более высокая степень сложности и гетерогенности гли-калитических ферментов. Известно, что в ЦНС, как и в мышчах, гликолиз всецело зависит от единственного субстрата - глюкозы, которая является практически единственный источником энергии для ткани головного мозга, т.е. гликолиз для ЦНС является «сиз— ненно важным путем метаболизма. Иэоферменгный спектр гликоли— тических Ферментов в ЦНС имеет свои особенности, несвойственные ни одному другому органу. Они выражаются в том, что ряд гликолитических ферментов в нервной ткани представлен уникальными или характерными для ЦНС изоферментами. Вначале специфичность изоферментов была установлена для нейроиспецифи— ческой ено.лаэы и 'альдолази С4. Затем был выявлен ряд физнхо — химических и Функциональных отличий и для других ферментоэ, локализованных в ЦНС, по сравнению с ферментами из других органов. В этой связи представляется интересным провести сраз-нительнае изучение камплексоойраэующсй способности мозгоспе— иифических и неспецифических изоферментов. Возможно, это поможет понять степень специализации надмолекулярной организации Ферментов в ЦНС и других органах. С другой стороны, до настоящего времени в центре внимания исследователей находились о основном ферменты, локализованные в дивергентных точках метаболических путей. Это обычно сложные ретуляторные ферменты, активность которых контролируется множеством факторов. Учитывая, что для получения однозначных ответов, как правило, хгелательио иметь дело с наиболее простой системой, сохраняющей изучаемые? свойства, представляется интересным проведение сравнительных исследований на ферментах, находящихся е дивергентных и мэди-вергентных участках метаболических путей. Действительно, если комплексообразование играьт вакну» роль в физиологии клетки, то структура и функции комплексов должны различаться о «зависимости от того, какие ферменти входят о его состав — "мерлоно-весные", регуляторние, находящиеся в точках ветвления пути или нет. На наш взгляд, целесообразна прозсети подобное исслэасзл— ние, выбрав в качестве объекта изучения систему форментса, катализирующую обмен фосфотриоз. Это изоферманты Є (альфа, Сета и гамма), РГМ (ММ и ВВ> и ПК (Ml и Н2>, которые яолетэтев весьма интересными объектами исследования надмолекулярной организации гликолитических ферментов. Реакция, каталиаирусиги Є, находится на недивергентном участке гликолиза, а Е известна как "равновесный" нерегуляторный фермент. РГИ — текке типичный равновесный "нерегуляторный" фермент, локализованный о мади-вергентном участке, а ПК — один из ключевых регуляторним ферментов гликолиза, находящийся в точке ветвления пути. Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении белок - белковых взаимодействий гликолитических ферментов катаболизма фосфотриоз и выявлении воа-
можмостей регуляции их актионости как при комплексообраэоеа-нии, так и при воэдействиии на них физиологически активных соединений эндогенной природы. Отсюда вытекают задачи иссле-дооания: изучить взаимодействия различных изоферментоз РГМ, Є и ПК с применением известных методов и разработать новые адекватные методы для выявления комплексообразования "растворимых" слабых комплексов гликолитических ферментов. Изучить действие физиологически активных аминокислот, метаболитов и гормонов на свойства нерегуляторных и регуляторних ферментов, их кинетические характеристики.
Научная иочиана работы. При помощи метода измерения анизотропии флуоресценции изоферментов Е, меченных ОИТЦ, впервые пока— но взаимодействие бета и гамма иооферментов Е с ММ и ВВ изо— феркгмтами РГМ и с Ml изооериеитом ПК. Как качественные, так и количественные характеристики комплексов подтверждаются при изучении их методами кинетического анализа, гель-фильтрации в объеме сефадекса, а также специально разработанного нами метода сэндвич HrJA. При оэаимодойстоии Е с РГМ актияность первой подавляется по типу смешанного ингибирования, которое снимается 2,3—дифосооглицератом — кофактором РГМ. Единственный эффективный эндогенный ингибитор єнолазнай реакции — ГаР, при совместном действии с РГМ действует кооперативно. Показано, что стероидный гормои эстрадная—17бета оказызает индуцирующее влияния только на регуляторные ферменты — ГК, РОК и ПК, но меняя актизности Е, РГМ и других "равновесных" гликолитических фер— иемтоэ. нктианость ГК меняется при краткосрочных экспозициях гормона, однако о этом случае изменяется но суммарная фермой— татизная актизность, а происходит перераспределение мембрано— связанного, применбранного и водорастворимого пулов фермента, что, вероятно, обеспечивает адекватное воздействии» гормона изменение актизности ПК.
Практическая оначимость работы. Проведенное исследование дает козу» информацию о формировании комплексов гликолитических Сермантсз. Согласно результатам работы, большая часть РГМ, Е и ПХ in vivo могут существовать в составе биферментных комплексов. Обнгрулсокное каление открыэает возможности для создания принципиальна нотаго вида иммунодиагностикумов, сконструированных на осноэо) антител к. бифермемтным коньнгатам, применение которых мояет служить диагностическим тестом при различных онкологических и нервно-психических оаболеоаниях. Определение бифермэнтного комплекса Е-РГМ или Е-ЛК создаст предпосылки для позыоения диагностической ценности такого широко известного диагностического маркера, каким является нейронспецифическая Е. Выпаленные закономерности регуляции активности РГМ, Е и ПК могут дать возможность целенаправленного воздействия на их активность in vivo через изменение гормонального статуса организма.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на< Всс-союомой конференции па биохимии нервной системы, Ереван 1932, Сов^тско-Француоском симпозиуме "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", Цхалгубо, 1982, XVI конференции ФЕБО, Москва, J9S4, Международном симпозиуме "Химическая физика ферментативного катализа", Таллинн, 1987, Международном биохимическом конгрессе, Прага 1988( VII Европейской нейрохимической конференции, Лейпциг, 1989, конференциях ИМБ "Вопросы молекулярно—клеточной биологии", 1985, 1983, Республиканских конференциях по физико-химической биологии 1986, 1989 и др. Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 16 статей.*
Объем и структура работы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста и содержит 50 рисунков и 14 таблиц. Библиография включает 287 наименований литературных источников на русском и английском языках.