Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Неферментативное гликозилирование коллагена в органах и тканях
1.1. Коллаген - основной белок соединительной ткани 7
1.2. Неферментативное гликозилирование коллагена 16
1.3. Факторы, сопровождающие неферментативное гликозилирование белка in vitro и in vivo 26
Глава 2. Клиническое значение изучения неферментативного гликозилирования коллагена в организме
2.1. Клинико-биохимическая характеристика гликозилированного коллагена органов и тканей при сахарном диабете и в старческом возрасте 33
2.2. Ингибиторы реакций гликозилирования белков 37
Материалы и методы исследований результаты собственных исследований 41
Глава 1. Модификация структуры коллагена в процессе неферментативного гликозилирования in vitro
1.1. Кинетики образования основных продуктов гликозилирования коллагена 53
1.2. Изменение структурной стабильности коллагена при гликозили-ровании in vitro 63
1.3. Гликозилирование коллагена in vitro при низкой концентрации глюкозы 76
Глава 2. Изменения биохимических и спектральных характеристик коллагена дермы кожи человека при гликозилировании in vitro
2.1. Структурная модификация коллагена дермы, гликозилированной in vitro 84
2.2. Фракционный состав и характеристика нерастворимой фракции коллагена дермы, гликозилированной in vitro 91
2.3. Особенности гликозилирования коллагена обезжиренной дермы кожи человека 102
Глава 3. Влияние ингибиторов реакций гликозилирования на показатели структурной модификации и свойства коллагена
3.1. Особенности гликозилирования коллагена in vitro в присутствии соединений, ингибирующих действие ионов металлов, активных форм кислорода и дикарбонил-содержащих соединений 113
3.2. Действие ацетилсалициловой кислоты на характеристики коллагена при гликозилировании in vitro 123
Обсуждение результатов исследований 129
Выводы 151
Список литературы
- Коллаген - основной белок соединительной ткани
- Клинико-биохимическая характеристика гликозилированного коллагена органов и тканей при сахарном диабете и в старческом возрасте
- Кинетики образования основных продуктов гликозилирования коллагена
- Структурная модификация коллагена дермы, гликозилированной in vitro
Введение к работе
Взаимодействие белков и, в частности, коллагена органов и тканей с углеводами, т.е. неферментативное гликозилирование, происходит при старении организма человека и лежит в основе патогенеза наиболее серьезных осложнений сахарного диабета (почечная недостаточность, катаракта, тромбозы, атеросклероз и др.) [50,69,137,169].
Процесс неферментативного гликозилирования коллагена, пусковым механизмом которого служит связывание глюкозы или других восстанавливающих Сахаров с боковыми аминогруппами этого белка, в конечном итоге приводит к изменению его молекулярной структуры и физико-химических свойств. Происходит нарушение конформации тройной спирали молекул коллагена, изменение распределения поверхностных зарядов, образование новых соединений в структуре белка и дополнительных внутри- и межмолекулярных поперечных связей. Все это вызывает функциональные нарушения соединительной ткани разных органов: ригидность стенок артерий, дисфункцию почечных капилляров, жесткость и гиперплазию дермы кожи, уменьшение эластичности и проницаемости базальных мембран и развитие других патологий [19,22,26,51,71,81,130,149,166].
В настоящее время проблема неферментативного гликозилирования коллагена in vivo и in vitro практически не разрабатывается в России и активно изучается в основном зарубежными биохимиками и практическими врачами. Однако многие принципиальные вопросы и конкретные биохимические механизмы изменения структуры этого белка остаются не до конца выясненными.
Так, в литературе основное внимание уделяется идентификации конкретных химических соединений, образующихся в результате гликозилирования белка [84,127,146,147,168], однако остаются не совсем понятными скорость и место образования этих продуктов, а также их вклад в патологическую модификацию структуры коллагена. Остается практически не изученным вопрос о роли телопептидов в изменении структурной стабильности гликозилированного коллагена. В литературе имеется мало данных по изучению кинетики реакций неферментативного гликозилирования чистых препаратов коллагена in vitro, особенно в течение длительного времени. Достаточно спорными остаются представления о роли окислительных процессов с участием активных форм кислорода, ионов хелатных металлов и образующихся активных дикарбонилов. Кроме того, большинство исследований процесса неферментативного гликозилирования коллагена в тканях in vitro проводятся на образцах сухожилий, тогда как показатели структурной модификации коллагена собственно кожи остаются мало изученными. И, наконец, в должной мере не исследованы факторы и механизмы регуляции реакций неферментативного гликозилирования коллагена на молекулярном и тканевом уровне in vitro, позволяющие лучше понять повреждение коллагеновых структур in vivo и представить пути возможного предупреждения и коррекции этих нарушений применительно к проблемам старения, диабета и других патологий.
Целью нашей работы являлось комплексное изучение изменений в структуре коллагена на молекулярном и тканевом уровнях в процессе неферментативного гликозилирования in vitro по ряду биохимических и биофизических показателей и исследование действия различных соединений, регулирующих этот процесс.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Изучить характер изменений биохимических и спектральных показателей коллагена (на коммерческом препарате белка) в процессе длительной инкубации с глюкозой, сроком до 1 года.
2. Исследовать скорость и место образования дополнительных поперечных связей и новых флуоресцирующих соединений в коллагеновых молекулах в процессе гликозилирования in vitro, используя обработку белка протео-литическими ферментами с разной специфичностью действия.
3. Оценить роль телопептидов в изменении структурной стабильности коллагена при гликозилировании in vitro.
4. Выяснить общие закономерности и различия в кинетике образования ранних и конечных продуктов гликозилирования коллагена под действием высокой концентрации глюкозы (1,5 М) и при концентрации в 20 раз ниже (0,070 М).
5. Изучить динамику изменения фракционного состава коллагена дермы кожи человека и образования дополнительных поперечных сшивок в структуре нерастворимого коллагена при неферментативном гликозилировании in vitro.
6. Исследовать влияние соединений, ингибирующих разные факторы или реакции гликозилирования белка (гуанидин хлорид, каталаза и диэтилен-триаминопентауксусная кислота, ацетилсалициловая кислота), на биохимические и спектрофлуориметрические характеристики коллагена при неферментативном гликозилировании in vitro.
Коллаген - основной белок соединительной ткани
Коллаген обладает уникальным строением, отличающим его как от глобулярных, так и от большинства фибриллярных белков. Он имеет характерный аминокислотный состав, свыше 50% его аминокислот составляют остатки глицина и иминокислот (пролина и оксипролина).
Первичная структура коллагена отличается высокой степенью регулярности: в каждом третьем положении полипептидной цепи находится глицин, за ним, как правило, расположен остаток пролина и часто повторяются участки: глицин-пролин-оксипролин. В коллагене имеются оксилизин и оксипролин, практически не встречающиеся в других белках. Также характерно крайне низ кое, по сравнению с глобулярными белками, содержание цистеина и ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина). Кроме того, в коллагене содержатся углеводные единицы, ковалентно связанные с остатками оксилизина, чаще всего это дисахарид галактозы и глюкозы [7].
Особенности первичной структуры коллагена определяют и характерную конформацию его макромолекул - тройную спираль, имеющую свойства жесткого стержня.
Молекула тропоколлагена, т.е. "молодого", недавно синтезированного белка, имеет следующие характеристики: молекулярная масса - около 285 кДа, длина молекулы - 300 нм, диаметр - 1,5 нм [10]. Это одна из самых длинных среди молекул известных белков. [42]
Спираль молекулы тропоколлагена состоит из трех закрученных одна вокруг другой полипептидных цепей, которые называют а-цепями [1].
Следует отметить, что молекула коллагена, помимо основной области тройной спирали, содержит неспирализованные концевые и боковые участки полипептидных цепей, называемые телопептидами. Эти участки являются низкомолекулярными пептидами (10-15 кДа) и имеют аминокислотный состав, отличный от типичного для спирализованной части молекулы: большее содержание ароматических аминокислот, меньшее количество глицина и иминокислот [7,10,98]. Роль телопептидов еще не до конца выяснена, но известно, что они принимают участие в фибриллообразовании, стабилизируя полимерные колла-геновые структуры путем образования поперечных ковалентных связей [98].
Из коллагеновых белков разных тканей позвоночных к настоящему времени выделено 38 различных а-цепей, которые кодируются разными структурными генами. На сегодняшний момент охарактеризовано более 20 типов коллагена, в зависимости от комбинации а-цепей в молекуле белка [118]. В организме человека наиболее распространенными являются первые четыре типа коллагена (Табл.1).
Надмолекулярным образованиям коллагена свойственна высокая степень структурной иерархии. Для разных тканей, в зависимости от их функциональ ного назначения, характерны различные высшие уровни организации коллагена, однако первичной надмолекулярной структурой фибрилл-образующих типов коллагена являются так называемые фибриллы нативного типа [8,10].
Самосборка фибрилл из молекул коллагена осуществляется за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий особым образом расположенных зон "неполярных" и "полярных" аминокислот. Молекулы в фибриллах укладываются параллельно, со смещением на 1/4 их длины и промежутком между их концами около 40 нм. Впоследствии фибриллы стабилизируются межмолекулярными ковалентными связями [7].
В свою очередь фибриллы, располагаясь параллельно друг другу, образуют коллагеновые волокна [90].
В формировании волокон кроме коллагена принимают участие другие компоненты основного вещества соединительной ткани - гликозаминогликаны, протеогликаны, гликопротеиды, белки неколлагеновой природы [1,7,12]. В некоторых высокоспециализированных структурах, таких как кости и зубы, происходит вторичное отложение кристаллов кальциевых солей фосфорной и угольной кислоты. Это взаимодействие придает ткани новые механические свойства [24,37].
Коллагеновые волокна составляют основу всех соединительно-тканных структур, различающихся по сложности и разнообразию организации. Например, в сухожилиях образуются пучки с параллельно расположенными волокнами. В дерме кожи человека коллагеновые волокна распределены в виде слабо ориентированной трехмерной сети с примерно параллельной укладкой вблизи эпидермиса и с расположенными под разными, в том числе и прямыми, углами к поверхности кожи в более глубоких слоях дермы, в зависимости от распределения механического напряжения. Подобный тип укладки волокон имеется и в клапанах крупных сосудов, и в хрящах различных типов. Наиболее сложная укладка волокон наблюдается в стенках трубчатых костей, строгая упорядоченность структуры которых соответствует возможной нагрузке [8,10,37,118].
Клинико-биохимическая характеристика гликозилированного коллагена органов и тканей при сахарном диабете и в старческом возрасте
Согласно литературным данным, можно выделить группу серьезных заболеваний, патогенез которых в той или иной степени связан с нарушениями в структуре коллагена в результате неферментативного гликозилирования [169].
В первую очередь, это ряд наиболее тяжелых осложнений сахарного диабета (нефропатия, сердечно-сосудистые заболевания, легочная недостаточность, ретинопатия и др.), а также заболевания старческого возраста [50,69,137]
Следует отметить, что патологии, осложняющие течение сахарного диабета, и заболевания, характерные для старческого возраста, имеют типичные проявления по клинической картине и сходны по ряду показателей биохимических изменений в организме. Более того, именно при сахарном диабете может наблюдаться так называемый синдром "ускоренного старения" организма [169].
В основе их патогенеза лежит повреждение соединительно-тканных структур разных органов, связанное, в том числе, с изменениями в структуре коллагена, составляющего основу внеклеточного матрикса соединительной ткани [166,178].
Неферментативное гликозилирование белков - это медленнотекущий процесс, поэтому наиболее выраженные изменения при старении и диабете, приводящие к серьезным патологиям, происходят именно в долгоживущих белках организма, особенно в коллагене [50,111]
Несмотря на разнообразие гипотез, большинство авторов сходится во мнении, что повреждение тканей и последующее развитие заболеваний происходит в результате образования в коллагене КПГ [19,26,51,81,149].
С помощью различных методов и у больных диабетом, и в результате возрастных изменений в организме было зарегистрировано накопление в коллагене соединительной ткани разных органов карбоксиметиллизина, пентозидина, вес-перлизина, кросслинов и других КПГ [57, 112,114,109].
Формирование КПГ в белке, как уже указывалось, вызывает наиболее серьезные изменения в его молекулярной структуре: образование внутри- и межмолекулярных сшивок; повреждение конформации тройной спирали колла-геновых молекул; появление новых продуктов, блокирующих определенные аминокислотные остатки лизина, оксилизина и аргинина, изменяя распределение поверхностных зарядов [21,32,40,86,93,138,142].
На уровне ткани такая структурная модификация коллагена приводит к нарушению клеточно-матриксных взаимодействий коллагена с клетками соединительной ткани (в которой участвует определенная аминокислотная последовательность из трех аминокислот, включая как раз аргинин), может происходить нарушение нормального процесса фибриллообразования (из-за изменения гидрофобности аминокислот), изменяется проницаемость базальных мембран (основу которых составляет коллаген IV типа), и, наконец, резко могут изменяться свойства фибриллярных структур (из-за образования сшивок) [22,71,74,130,166].
Для подтверждения участия КПГ в нарушении функциональной активности тканей Vlassara Н. с коллегами показали, что введение этих соединений, выделенных из гликозилированного in vitro белка, в организм нормальных крыс вызывало изменение соединительной ткани, типичное для патологии при диабете и старении: утолщение базальной мембраны, гипертрофию почечных клубочков и ригидность стенок сосудов [178].
Образование КПГ в коллагеновых структурах при гликозилировании приводит к изменению физико-химических и функциональных свойств наиболее чувствительных тканей, таких как базальная мембрана почечных канальцев и кровеносных капилляров, соединительно-тканные структуры сердечнососудистой системы и легких. Коллагенсодержащие ткани при этом становятся более жесткими, менее упругими и эластичными [20,22,56,166,190].
Например, наиболее видимые изменения и при старении, и при сахарном диабете происходят в коже человека. Известно, что дерма кожи взрослого человека содержит 75-80% коллагена от всего компонентного состава. Структурная модификация ее основных фибриллярных структур может существенно изменять ее физико-химические свойства и приводить к заметному "старению" кожи: дряблости, потери эластичности, изменению цвета и др. [103,144,175]. При этом состояние коллагена дермы в результате его неферментативного гликози-лирования in vitro и in vivo остается не до конца изученным.
Повреждение структуры коллагена стенок капилляров приводит к возникновению микроваскулярных нарушений, лежащих в основе патогенеза нефро-патии, ретинопатии и нейропатии [19,26,53].
Кроме того, было обнаружено, что КПГ, содержащиеся в коллагене, усиливают его способность индуцировать агрегацию тромбоцитов, что повышает риск тромбообразования при заболевании сахарным диабетом и при старении организма [77,102].
Кинетики образования основных продуктов гликозилирования коллагена
Модификация структуры коллагена в процессе неферментативного гликозилирования, как известно, сопровождается образованием ранних, промежуточных и конечных продуктов, различающихся по своим биохимическим, физико-химическим и спектральным характеристикам [16,39,43,93,149].
Вместе с тем выяснение скорости образования в коллагене продуктов разных стадий процесса неферментативного гликозилирования при длительном действии глюкозы in vitro, уточнение участка молекулы коллагена, участвующей в образовании дополнительных поперечных сшивок, детальная спектро-флуориметрическая характеристика образующихся продуктов на разных сроках гликозилирования, определение влияния концентрации глюкозы на весь процесс представлялись необходимыми для более полного понимания особенностей изменений в структуре коллагена на молекулярном уровне.
В начале наших исследований основной задачей было изучить кинетические закономерности образования основных продуктов гликозилирования коллагена на разных этапах неферментативного гликозилирования in vitro. Для моделирования этого процесса коллаген (коммерческий препарат фирмы "Serva") инкубировали с глюкозой в течение разных сроков, вплоть до 12 месяцев. Длительный срок инкубации, а также высокая концентрация глюкозы (1,5 М) использовались для получения наиболее выраженных изменений в результате процесса гликозилирования коллагена in vitro. В качестве контролей использовали образцы коллагена, инкубированные в тех же условиях без глюкозы.
Образование в коллагене ТБК-актнвных продуктов
В качестве критерия образования ранних продуктов гликозилирования коллагена (Шиффовы основания, продукты Амадори) использовали фотометрический метод, специфический для кетоаминосвязанных гексоз (например, фруктозолизина). Этот метод основан на реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), продукты которой имеют характерный максимум спектра поглощения при 443 нм [131,145].
Кинетика образования и накопления в коллагене ТБКтактивных продуктов в процессе его инкубации с глюкозой (в течение 12 месяцев) представлена на рис. 18.
Видно, что инкубация коллагена с глюкозой приводила к повышению содержания в нем продуктов, вступающих в реакцию с ТБК, тогда как в контрольных образцах этого не наблюдалось. В условиях нашего эксперимента наибольшая скорость образования ТБК-активных продуктов отмечалась в течение первых 5-ти суток инкубации коллагена с глюкозой. За этот срок их колй чество по сравнению с исходным "фоновым" значением увеличивалось приблизительно в 2 раза. При более длительной обработке коллагена глюкозой (в течение 1-го, 2-х и 5-ти месяцев) скорость накопления в белке ТБК-активных продуктов постепенно замедлялась, однако их содержание продолжало повышаться, увеличиваясь, по сравнению с контролем, в примерно в 3, 4 и 5 раз, соответственно, через 1, 2 и 5 месяцев гликозилирования in vitro. После 5 месяцев инкубации коллагена с глюкозой, вплоть до 12 месяцев, содержание ТБК-активных продуктов в белке уже не увеличивалось.
В контрольных образцах коллагена, инкубированных в течение тех же сроков (вплоть до 12 месяцев) без глюкозы, количество ТБК-активных продуктов не изменялось.
На основании полученных данных можно предположить, что образование и накопление ранних продуктов гликозилирования, быстро появляющихся в структуре коллагена уже в первые несколько суток его инкубации с глюкозой, может продолжаться в течение очень длительного срока (в наших условиях -до 5 месяцев).
Известно, что Шиффовы основания и продукты Амадори являются предшественниками последующего каскада реакций гликозилирования белка, поэтому кинетика их накопления в коллагене должна быть обусловлена не только скоростью их образования, но и интенсивностью реакций их распада и дальнейшего химического превращения до промежуточных и конечных продуктов гликозилирования. Для более полной картины изменений, происходящих в коллагене при гликозилировании, целесообразно было также рассмотреть кинетику образования более поздних продуктов, а именно продуктов окисления белка и флуоресцирующих соединений.
Структурная модификация коллагена дермы, гликозилированной in vitro
Исследования проводили in vitro, инкубируя образцы дермы с 0,7 М глюкозой, в тех же условиях, что и образцы коммерческого препарата коллагена.
На рис. 30 представлены данные по величине гидролиза коллагена дермы под действием коллагеназы, пепсина и проназы в результате инкубации образцов дермы с глюкозой в течение 1, 5 и 12 месяцев. В качестве контроля использовались образцы, инкубированные в тех же условиях без глюкозы.
Как видно из полученных данных, в течение 1-12 месяцев инкубации дермы с глюкозой изменялась структурная устойчивость коллагена к действию всех трех протеолитических ферментов.
Однако величина гидролиза коллагена под действием коллагеназы уменьшалась незначительно в течение всего срока инкубации с глюкозой: за 1 месяц - с 96% до 83%; но даже на поздних сроках, через 5 и 12 месяцев - всего до 76% и 71%, соответственно.
Степень гидролиза белка пепсином снижалась в течение 1-го месяца также незначительно, с 69% всего до 43%, и только через 5-12 месяцев резко уменьшалась до 4%.
В случае действия проназы снижение величины протеолиза белка отмечалось только в течение 1-го месяца инкубации дермы с глюкозой: с 18% до 12%, тогда как на поздних сроках, 5 и 12 месяцев, обнаруживалось, наоборот, выраженное повышение этого показателя: до 73% и 62%, соответственно.
Полученные данные также, как и представленные в главе 1 результаты исследования гликозилированных образцов коммерческого препарата коллагена, свидетельствуют о том, что в процессе неферментативного гликозилирования образцов дермы in vitro в коллагеновых структурах этой ткани происходит образование дополнительных поперечных сшивок, локализованных как в спира-лизованной области молекул коллагена (на основании данных по устойчивости белка к действию коллагеназы), так и в области телопептидов (по устойчивости к действию пепсина). Подтверждается и полученный нами ранее результат по увеличению степени гидролиза гликозилированного коллагена проназой: аналогично изменяется и коллаген, входящий в состав дермы кожи человека. Вместе с тем отмечались четкие различия в зависимости от структурной организации коллагена.
В коллагене дермы, в отличие от гликозилированного коммерческого препарата белка, все изменения структурной устойчивости к действию коллагеназы и пепсина происходили более медленно. Возможно, это обусловлено существованием изначальной специфической фибриллярной организации коллагена в ткани, реагирующей в меньшей степени, чем чистый белок, на модифицирующее действие глюкозы.
Кроме того, гликозилированный коллаген дермы не достигал высокой степени устойчивости к действию коллагеназы даже на очень длительных сроках инкубации с глюкозой (через 12 месяцев величина гидролиза выше 70%). Это свидетельствует о выраженном снижении количества образующихся связей в спирализованной области коллагеновых молекул, входящих в состав дермы.
Вместе с тем, различия по устойчивости к действию пепсина, четко обнаруживаемые на ранних сроках гликозилирования in vitro по высокой растворимости коллагена дермы (через 1 месяц выше 40%), в свою очередь, свидетельствуют о резком снижении скорости образования дополнительных связей в области телопептидов коллагена дермы, по сравнению с молекулами чистого белка; хотя на поздних сроках гликозилирования низкая величина гидролиза пепсином (через 5-12 месяцев - всего 4%) указывает на формирование сшивок именно в концевых участках коллагеновых молекул.
Также, по сравнению с препаратом коллагена, в коллагеновых структурах дермы кожи на поздних сроках гликозилирования (5-12 месяцев) отмечалась значительно более высокая чувствительность структуры коллагена дермы к протеолитическому действию проназы (около 70% величина гидролиза).
Рассмотрим теперь изменение спектральных характеристик коллагена дермы в процессе гликозилирования in vitro. Следует отметить, что при визуальной оценке наблюдалось четко выраженное изменение цвета дермы: от светло-желтого до темно-коричневого, в зависимости от продолжительности гликозилирования.
На рис. 31 представлены типичные спектры возбуждения флуоресценции с длиной волны 450 нм щелочных гидролизатов дермы, инкубированной без глюкозы (контроль) и с глюкозой в течение 1 и 5 месяцев. Видно, что через 1 месяц гликозилирования интенсивность флуоресценции образцов по сравнению с контролем возрастала примерно в 2-3 раза при возбуждении в диапазоне 300-400 нм, с четким появлением двух пиков: 335 нм и 370 нм. Через 5 месяцев гликозилирования наибольшее увеличение интенсивности флуоресценции (еще примерно в 2-3 раза) наблюдалось при возбуждении в области 300-370 нм, со смещением максимума спектра от 320 нм (в контроле) до 335 нм.
