Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Нейропротекторное действие инсулина на моделях in vitro и in vivo и его возможные механизмы Зорина Инна Игоревна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Зорина Инна Игоревна. Нейропротекторное действие инсулина на моделях in vitro и in vivo и его возможные механизмы: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.04 / Зорина Инна Игоревна;[Место защиты: ФГБУН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук], 2020

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Инсулин и инсулиновые рецепторы в ЦНС 11

1.2. Инсулиновая сигнальная система в ЦНС 14

1.3. Функциональное значение инсулина в головном мозге 20

1.3.1. Роль инсулина в регуляции гомеостаза глюкозы и пищевого поведения 20

1.3.2. Инсулин как ростовой фактор 22

1.3.3. Нейромодуляторные эффекты инсулина 23

1.3.4. Влияние инсулина на когнитивные функции 23

1.3.5. Нейропротекторное действие инсулина 24

1.4. Свободнорадикальное окисление биомолекул и его биологическая роль в мозге .26

1.5. Антиоксидантная система и особенности ее функционирования в ЦНС 33

1.6. Редокс-зависимые сигнальные пути 37

1.7. Механизмы патогенеза ишемии головного мозга 38

1.8. Экспериментальные модели ишемического повреждения головного мозга 45

1.9. Предпосылки использования инсулина для терапии ишемии головного мозга. Интраназальный способ доставки 47

Глава 2. Материалы и методы исследования 51

2.1. Материалы 51

2.2. Экспериментальные модели индукции окислительного стресса на первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс in vitro 51

2.2.1. Выделение первичной культуры нейронов коры головного мозга крыс 51

2.2.2. Индукция окислительного стресса добавлением перекиси водорода 52

2.2.3. Модель депривации глюкозы и кислорода in vitro 53

2.3. Экспериментальная модель глобальной двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс с гипотензией и реперфузией 53

2.4. Метод определения жизнеспособности нейронов первичной культуры коры головного мозга крыс (МТТ-тест) 55

2.5. Определение активности каспазы-3 55

2.6. Метод определения образования активных форм кислорода в нейронах первичной культуры коры головного мозга крыс 55

2.7. Определение наличия специфических белков методом иммуноблоттинга 56

2.8. Определение уровня мембранного потенциала митохондрий нейронов первичной культуры коры головного мозга крыс методом проточной цитометрии 58

2.9. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, совмещенная с обратной транскрипцией 58

2.9.1. Выделение тотальной РНК 58

2.9.2. Обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией 59

2.9.3. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени 59

2.9.4. Анализ данных полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени 60

2.10. Изучение уровня продуктов перекисного окисления липидов 61

2.10.1. Выделение липидов из тканей животных по методу J. Folch 61

2.10.2. Метод количественного определения диеновых и триеновых конъюгатов 61

2.10.3. Метод количественного определения оснований Шиффа 62

2.10.4. Метод определения содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой 2.11. Выделение субклеточных фракций 62

2.12. Определение активности супероксиддисмутазы 63

2.13. Определение активности Na+/K+-АТФазы 64

2.14. Метод определения уровня общего глутатиона 64

2.15. Статистическая обработка данных 65

Глава 3. Результаты исследования 66

3.1. Изучение механизмов защитного действия инсулина на нейроны первичной культуры коры головного мозга крыс, подвергнутые действию перекиси водорода in vitro 66

3.1.1. Исследование защитного действия инсулина на нейроны коры мозга крыс, подвергнутые действию перекиси водорода in vitro 66

3.1.2. Изучение влияния инсулина на генерацию активных форм кислорода при добавлении перекиси водорода в нейронах коры мозга крыс in vitro 68

3.1.3. Изучение механизмов, лежащих в основе защитного действия инсулина, в динамике развития окислительного стресса в нейронах коры мозга крыс in vitro 71

3.1.4. Исследование влияния ингибиторов PI-3-К/Akt- и MEK1/2 / ERK1/2 –путей и активатора AMPK на защитный и антиоксидантный эффекты инсулина в условиях окислительного стресса, индуцированного H2O2, на нейронах коры мозга крыс 83

3.2. Исследование защитного действия инсулина и его механизмов на нейроны первичной культуры коры головного мозга крыс в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro 86

3.2.1. Изучение защитного и антиоксидантного действия инсулина на нейроны коры головного мозга крыс в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro 87

3.2.2. Исследование влияния инсулина на активность протеинкиназ Akt, GSK3, ERK1/2 и уровень Bax и Bcl-2 в модели депривации глюкозы и кислорода in vitro на нейронах коры головного мозга крыс 89

3.3. Анализ механизмов действия инсулина, вводимого интраназально, при двухсосудистой ишемии переднего мозга крыс с гипотензией и реперфузией 94

3.3.1. Изучение влияния инсулина, вводимого интраназально, на уровень продуктов перекисного окисления липидов в коре мозга крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 94

3.3.2. Исследование влияния инсулина, вводимого интраназально, на активность и экспрессию Na+/K+-АТФазы в коре мозга и гиппокампе крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 95

3.3.3. Исследование влияния инсулина при интраназальном введении на уровень некоторых компонентов защитных, в том числе антиоксидатной, систем в коре мозга крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 99

3.3.4. Изучение влияния инсулина при интраназальном введении на активность сигнальных путей в коре мозга и гиппокампе крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии 102

Глава 4. Обсуждение результатов 109

Заключение 121

Выводы 122

Список сокращений 123

Список литературы 124

Инсулиновая сигнальная система в ЦНС

Функционирование сигнальных каскадов в ЦНС, регулируемых инсулином, имеет схожие черты с таковыми на периферии. Основными эффектами активации инсулиновой сигнальной системы в мышечных тканях, гепатоцитах и адипоцитах являются встраивание транспортера глюкозы GLUT4 в плазматическую мембрану и транспорт глюкозы в клетки. В ЦНС инсулиновая сигнальная система тесно взаимосвязана с другими сигнальными системами, которые регулируются нейромедиаторами и гормонами. Также имеются различия в микроокружении ИнсР в головном мозге, которые обуславливают функциональные особенности рецептора. На рисунке 1.2 кратко представлена общая схема сигнальных путей, регулируемых инсулином.

При связывании инсулина с -субъединицей ИнсР происходит изменение ее конформации, а также изменение конформации функционально связанной с ней -субъединицы рецептора. В результате активируется тирозинкиназный домен, находящийся в цитоплазматической части -субъединицы, его активация приводит к аутофосфорилированию по трем остаткам тирозина – Tyr1146, Tyr1150 и Tyr1151. Этот процесс является эволюционно древним и высоко консервативным, и одинаково протекает в нейронах и клетках периферических тканей (Перцева, Шпаков, 2002). Фосфорилированная -субъединица становится мишенью для взаимодействия с ИРС, а также с рядом других регуляторных и адапторных белков, имеющих фосфотирозинсвязывающие участки, что приводит к активации нижележащих компонентов инсулиновой сигнальной системы (Taguchi, White, 2008).

В настоящее время известно шесть изоформ ИРС-белков – четыре полноразмерные (ИРС-1–ИРС-4) и две укороченные (ИРС-5 и ИРС-6) изоформы. Ведущую роль в инсулиновом сигнальном пути играют ИРС-1 и ИРС-2, которые обнаруживаются почти во всех типах клеток и тканей. ИРС-1 и ИРС-2 содержат в N-концевой части плекстрингомологичный домен и следующий за ним фосфотирозинсвязывающий домен. Плекстрингомологичный домен обеспечивает взаимодействие ИРС-белка с ИнсР при его фиксации вблизи плазматической мембраны с помощью его связывания с фосфорилированными по третьему положению фосфоинозитидами (Razzini et al., 2000). Фосфотирозинсвязывающий домен способен узнавать фосфорилированные NPXY-мотивы в -субъединице ИнсР, что обеспечивает прочность взаимодействия между фосфорилированным ИнсР и ИРС-белком (Eck et al., 1996). Вслед за фосфотирозинсвязывающим доменом следует протяженный участок, в котором обнаружено более 20 сайтов для фосфорилирования по остаткам тирозина. В С-концевой части ИРС-1 и -2 располагается домен, отвечающий за взаимодействие с SH2-доменсодержащими белками, основными эффекторами инсулиновой сигнальной системы.

Функционально ИРС-1 участвует в регуляции инсулином метаболических и ростовых процессов в основном на периферии, в то время как ИРС-2 в большей степени вовлечен в реализацию эффектов инсулина в ЦНС, включая контроль роста и дифференцировки нейрональных клеток, центральную регуляцию пищевого поведения, гомеостаза глюкозы и эндокринных функций (Razzini et al., 2000).

С помощью фосфорилирования ИРС-1 и -2 по остаткам серина и треонина осуществляется негативная регуляция. Так, фосфорилирование c-Jun N-концевой киназой-1 (JNK1) приводит к выключению этих белков из передачи сигнала, что может служить одной из причин развития инсулиновой резистентности (Aguirre et al., 2002). Другим негативным регулятором инсулинового сигналинга является протеинтирозинфосфатаза PTP1B, дефосфорилирующая ИнсР и ИРС по остаткам тирозина, что приводит к блокированию сигнала (Bakke, Haj, 2015). Белки, содержащие SH2-домены, специфично взаимодействуют с SH2-доменом ИРС-белков, которые фосфорилированны по тирозинам в их составе. К таким белкам относятся компоненты различных сигнальных каскадов – фосфатидилинозитол-3-киназа (PI-3-K), протеинфосфотирозинфосфатаза SHP2, нерецепторная тирозинкиназа Fyn, супрессоры цитокинового сигналинга, адапторный GRB2-белок (Taguchi, White, 2008), которые ответственны за регуляцию зависимых от инсулина транскрипционных факторов.

Гетеродимерные PI-3-K являются основной мишенью ИРС-белков. PI-3-K состоят из регуляторной и каталитической субъединиц и катализируют синтез вторичного мессенджера – фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PI-3,4,5-P3) (Vanhaesebroeck et al., 2010). PI-3,4,5-P3 связывается с плекстрингомологичными доменами 3-фосфатидилинозитол-зависимой протеинкиназы 1- и 2-го типов (phosphatidylinositol-dependent protein kinase 1/2, PDK1/2) и с Akt-киназой, также обозначаемой как протеинкиназа В, что приводит к их перемещению к плазматической мембране. Akt-киназа является серин/треониновой киназой и представлена тремя изоформами: Akt1, Akt2 и Akt3. Экспрессия изоформ Akt зависит от типа клеток и отдела мозга. Например, Akt1 and Akt3 в основном представлены в гиппокампе, в то время как Akt2 в преимущественно встречается в астроцитах, но не в нейронах гиппокампа (Levenga et al., 2017). Akt-киназа регулирует везикулярный транспорт, транспорт глюкозы, организацию цитоскелета, клеточный метаболизм, выживаемость клеток и их пролиферацию (Noguchi, Suizu, 2012). После связывания с мембраной протеинкиназа PDK1 фосфорилирует Akt-киназу по остатку треонина в положениях 308/309/305 в составе каталитического сайта Akt1/2/3, соответственно. Другие протеинкиназы – mTORC2 (mammalian target of rapamycin Complex 2) и ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-dependent protein kinase, DNA-PK) фосфорилируют Akt-киназу по остатку серина в 473/474/472 положениях в составе С-концевого домена Akt1/2/3 (Noguchi and Suizu, 2012). Таким образом, Akt-киназа оказывается фосфорилированной сразу по двум сайтам, что ведет к полной активации фермента, в результате чего Akt-киназа фосфорилирует значительное число эффекторных нижележащих белков, участвующих в регуляции экспрессии генов, ростовых и метаболических процессов, выживаемости, ангиогенеза, дифференцировки клеток, что указывает на исключительно важную роль Akt-киназы в контроле жизнедеятельности клеток. Одним из основных эффектов Akt-киназы является перенос и встраивание в плазматическую мембрану инсулин-зависимого транспортера GLUT4, что обеспечивает захват клетками глюкозы (Hemmings, Restuccia, 2012).

Одной из важнейших функций инсулина считается регуляция им биосинтеза белка, которая осуществляется с помощью комплекса mTORC1. После активации Akt-киназа фосфорилирует по остаткам Ser939 и Thr1462 адапторный белок TSC2 (Tuberous Sclerosis Protein 2), который является негативным регулятором комплекса mTORC1, что снимает блокирующее влияние TSC2 на активность mTORC1 и ведет к его активации. mTORC1 в свою очередь ингибирует индукцию аутофагии и активирует рибосомальную p70-S6-киназу и транскрипционный фактор инициации трансляции eIF4E, что способствует регуляции биогенеза рибосом, транскрипции, инициации трансляции и деградации белков (Wang, Proud, 2006, Stoica et al., 2011).

Инсулин с помощью активации Akt-киназы и фосфорилирования нижележащей киназы-3 гликогенсинтазы (GSK3) регулирует метаболизм гликогена в тканях. Akt-киназа фосфорилирует GSK3 по Ser21 в случае изоформы GSK3 или по Ser9 в случае изоформы GSK3. Фосфорилирование по этим остаткам ведет к инактивации фермента. Таким образом, Akt-киназа ингибирует GSK3 и блокирует ее влияние на активность гликогенсинтетазы – ключевого фермента синтеза гликогена (McCubrey et al., 2014). В последнее время широко изучаются независимые от регуляции синтеза гликогена функции GSK3. Ингибирование GSK3 исключает ее влияние на активность множества транскрипционных факторов и их регуляторов, включая факторы NF-B, Snail, Notch, BAD, а также Forkhead-транскрипционные факторы, что обусловливает ключевую роль каскада ИРС-1/PI-3-K/Akt/GSK3 в реализации эффектов инсулина на экспрессию генов, апоптоз и выживаемость клеток (Cohen, Frame, 2001, McCubrey et al., 2014, Beurel et al., 2015).

В литературе описано несколько механизмов негативной регуляции 3 фосфоинозитидного пути. Среди таких регуляторов выступают фосфатазы – протеинфосфатаза PP2A, фосфатаза PTEN и протеинфосфатазы PHLPP-1 и PHLPP-2 (Hemmings, Restuccia, 2012). Фосфатаза PTEN предотвращает синтез 3-фосфоинозитидов, осуществляя гидролиз PI-3,4,5-P3, в то время как фосфатазы PP2A и PHLPP1/2 дефосфорилируют Akt-киназу, ингибируя ее активность. Другим негативным регулятором 3-фосфоинозитидного пути является SH2-содержащая инозитол-5 -фосфатаза 2-го типа SHIP2, экспрессия которой показана в различных отделах мозга (Accardi et al., 2014).

Предпосылки использования инсулина для терапии ишемии головного мозга. Интраназальный способ доставки

В терапии ишемического инсульта выделяют два основных направления: восстановление кровотока в зоне ишемического повреждения и нейропротекция клеток в зоне пенумбры тканей мозга. Однако введение препаратов обычно производится внутривенно, что может быть затруднено в виду ухудшенного состояния сосудов больного, а также из-за нарушенного кровотока в зоне инфаркта. Поиск нейропротекторов, изучение молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе нейропротекции и восстановления тканей мозга после повреждения, а также поиск новых способов доставки становятся актуальной задачей.

В 1980-2000 гг. в литературе широко исследовалось защитное действие инсулина при моделировании ишемии, как на здоровых животных, так и при сахарном диабете разного типа. Однако, эти работы не получили значительного продолжения ввиду выявляемой гипогликемии при внутривенном (Guyot et al., 2000a, 2000b), подкожном (Fukuoka et al., 1989, Meden et al., 2002), а также внутрибрюшинном (Izumi et al., 1992) введении инсулина в различных дозах. Но некоторые авторы рассматривают гипогликемию (2-3 ммоль/л), как один из механизмов противоишемического эффекта инсулина. Использование инсулина при периферическом введении в качестве экстренного гипогликемического препарата может быть рекомендовано при ишемии у больных с гипергликемией выше 10-11 ммоль/л. Мета-анализ, включащий 35 рандомизированных исследований, показал, что введение инсулина для контроля уровня глюкозы снижало смертность в краткосрочном периоде на 15% у пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда, однако в более поздних крупных исследованиях положительного эффекта обнаружено не было (McCormick et al., 2008).

Эксперименты по интрацеребровентрикулярному введению инсулина обнаружили его высокую эффективность при ишемии головного мозга. В модели ишемии переднего мозга центральное введение инсулина снижало не только размер инфаркта мозга, но и приводило к улучшению когнитивных способностей животных, перенесших ИР (Zhu, Auer, 1994, Wass et al., 1996). Исследования на культурах клеток и в моделях на животных пролили свет на некоторые механизмы защитного действия инсулина при различных повреждениях, независимых от контроля гликемии. На моделях ИР показано, что инсулин подавляет транскрипцию провоспалительных факторов при ишемии в эндотелиоцитах, что способствует сохранению целостности ГЭБ и препятствует распространению эдемы мозга (Aljada et al., 2000). Инсулин-опосредованная активация Akt-киназы, которая приводит к повышению экспрессии eNOS в эндотелиальных клетках и генерации продукции NO, что способствует снижению симпатической активности, активации АТФ-зависимых K+-каналов и высвобождению вазодилататора аденозина (Hung et al., 2014, McKay, Hester, 1996). Расширение сосудов при этом и приток крови улучшают состояние ишемизированной ткани, увеличивают зону ишемической полутени, что в конечном итоге снижает зону инфаркта мозга (Aljada et al., 2000).

Другим механизмом действия инсулина может быть его нейротрофическое и нейромодуляторное действие, обеспечивающие повышение роста нейритов, регенерацию миелинизированных волокн (Duarte et al., 2012), положительное влияние на выживаемость симпатических и сенсорных нейронов (Recio-Pinto, Rechler, Ishii, 1986), усиление нейтротрансмиссии (Guyot et al., 2000a, 2000b) и улучшение когнитивных функций (Craft et al., 2012).

Инсулин можно рассматривать как потенциальный нейропротекторный препарат. Его комплексное влияние на физиологию и плейотропные эффекты на ЦНС позволяют вмешиваться в ключевые патологические процессы, которые разворачиваются сразу после ишемии и ишемического инсульта. Это выступает несомненным преимуществом по сравнению с другими нейропротекторными кандидатными препаратами, которые действуют фокусно в рамках ишемического каскада, что может обуславливать их неэффективность при клинических испытаниях.

В настоящее время интраназальное введение используется для широкого спектра веществ – ростовых факторов, гормонов, лекарственных средств, стволовых клеток (Gnger, Schindowski, 2018). Основным преимуществом интраназального введения препаратов являются адресная доставка в ЦНС веществ, не имеющих возможности проникать через ГЭБ вследствие своего размера, заряда или иных физических, химических, биологических свойств и особенностей. Данный подход обеспечивает их более высокую биодоступность, быстрое достижение терапевтического эффекта, а также неинвазивность и удобство применения по сравнению с пероральным или инъекционным способом доставки лекарственных препаратов. Важной особенностью интраназального введения является отсутствие прохождения через печеночный барьер, что позволяет использовать более низкие дозы препаратов, снижающие побочные эффекты.

Данные, полученные при применении инсулина интраназально на здоровых людях, не вызывают никаких опасений при его кратко- и долгосрочном использовании, напротив, большинство проведенных исследований указывают на его положительное влияние на когнитивные функции. Длительная история применения инсулина в медицине также является несомненным преимуществом (Craft et al., 2012). А показанная эффективность IGF-1 при интраназальном введении животным, подвергнутым ИР (Lin et al., 2009, Kooijman et al., 2009), позволяет предположить наличие нейропротекторного действия и интраназально вводимого инсулина (ИИ).

Фармакокинетика и фармакодинамика ИИ у грызунов широко исследованы. После внесения в носовую полость инсулин попадает на слизистую оболочку носа, где он может транспортироваться внутриклеточным путем при рецепторопосредованным эндоцитозе, параклеточным или трансклеточным путями. В зависимости от используемых методических подходов и времени эксперимента авторами предлагаются различные схемы распространения инсулина в головном мозге. Их объединяет распространение инсулина вдоль обонятельного и тройничного нервов, по которым инсулин быстро распределяется в вентральном и дорсальном направлении (Рисунок 1.6).

Максимальная концентрация инсулина через 15-30 минут после его введения по разным данным обнаруживается в обонятельных луковицах, стриатуме, черной субстанции, стволе мозга, мозжечке, затем в меньшем количестве в гиппокампе и коре мозга (Fan et al., 2018, Picone et al., 2018). При этом через 60 мин его количество в тканях мозга снижается, но остается достоверно повышенным через 6 ч после введения (Fan et al., 2018). Также обнаруживается повышение уровня инсулина в спинно-мозговой жидкости, при этом ИИ не снижает уровень глюкозы на периферии, что показано во множестве работ (Picone et al., 2018, Lochhead et al., 2019).

Попадая в ЦНС, инсулин связывается с ИнсР, что приводит к активации соответствующих сигнальных путей, в частности PI-3-K/Akt-пути (Fan et al., 2018, Picone et al., 2018). Увеличение соотношения pAkt (Ser473)/Akt показано в обонятельных луковицах, коре мозга, гиппокампе и черной субстанции через 15-30 мин после интраназального введения, и его снижение описано через 60 мин (Fan et al., 2018, Picone et al., 2018).

Изучение механизмов, лежащих в основе защитного действия инсулина, в динамике развития окислительного стресса в нейронах коры мозга крыс in vitro

Активацию инсулином PI-3-К/Akt-сигнального пути рассматривают как основной механизм его действия. Одной из мишеней Akt-киназы является киназа GSK3, Akt-опосредуемое фосфорилирование которой по Ser9 приводит к ее инактивации и ингибированию ее проапоптотического потенциала (Ramalingam, Kim, 2015). Важную роль в регуляции апоптоза также играют белки Bax и Bcl-2, от уровня экспрессии и активности которых зависит судьба клеток при неблагоприятных условиях (Pugazhenthi et al., 2000). Мы исследовали способность инсулина модулировать активность Akt-киназы, GSK3 и влиять на уровни экспрессии про- и антиапоптотического белков Bax и Bcl-2 в динамике развития H2O2-индуцированного окислительного стресса в нейронах первичной культуры коры мозга крыс. Первым этапом при выполнении этой задачи стало изучение базового уровня активации протеинкиназ, контролирующих внутриклеточные сигнальные каскады, при добавлении инсулина. Под активностью сигнальных протеинкиназ понимается изменение отношения уровня фосфорилирования по определенным сайтам, которые связаны с регуляцией активности, к общему количеству фермента. Вторым этапом стало исследование механизмов защитного действия инсулина при H2O2-индуцированном окислительном стрессе.

Преинкубация клеток с 1 мкМ инсулином в течение 1 ч, а затем инкубация в течение 6 ч не приводили к изменению содержания Akt-киназы в нейронах (Рисунок 3.1.5 (Б)), но сопровождались ее активацией, что оценивалось по уровню ее Ser473-фосфорилированной формы, нормализованному к общему количеству фермента. Так соотношение pAkt(Ser473)/Akt достоверно повышалось, в среднем в 3 раза, по сравнению с контролем на всем протяжении эксперимента (p 0.01) (Рисунок 3.1.5 (А)).

В следующей серии экспериментов показано, что инсулин в концентрации 100 нМ в среднем в 5 раз увеличивал базальную активность Akt-киназы, также оцениваемую по уровню pAkt (Ser473)/Akt, при его добавлении за 60 мин до индукции окислительного стресса (p 0.01) (Рисунок 3.1.6 (А), точка 0). Перекись водорода в наибольшей степени увеличивала содержание pAkt (Ser473)/Akt через 15-30 мин после начала ее воздействия (Рисунок 3.1.6). Участие перекиси водорода в активации различных сигнальных путей широко изучено, как в нашей лаборатории (Аврова и др., 2008, Соколова и др., 2011, Захарова и др., 2013, Zakharova et al., 2012, 2014, 2017), так и другими группами исследователей (Son et al., 2013, Moldogazieva et al., 2018). Преинкубация со 100 нМ инсулином в значительной степени повышала уровень pAkt (Ser473)/Akt на разных этапах воздействия H2O2 по сравнению с группой «H2O2», и этот эффект сохранялся на всем протяжении эксперимента (p 0.05).

Инактивация GSK3 инсулином может определять не только его защитный, но и антиоксидантный эффект (Duarte et al., 2008, Frster et al., 2010, Ramalingam, Kim, 2015). Нами был изучен уровень pGSK3 (Ser9) по отношению к уровню нефосфорилированной формы GSK3 при действии одного инсулина и после добавления H2O2. При изучении влияния инсулина на базовый уровень фосфорилированной формы pGSK3 (Ser9) было показано, что инсулин повышал уровень pGSK3 (Ser9)/GSK3 в контрольных нейронах в 1.82 раза через 15 мин после его добавления, и этот эффект достоверно сохранялся до 60 мин инкубации (p 0.05) (Рисунок 3.1.7 (А)). При этом достоверного влияния инсулина на общее содержание белка GSK3 не было обнаружено (Рисунок 3.1.7 (Б)).

Данные представлены как М ± m (n=4). Различия достоверны: - p 0.05. В -репрезентативные иммуноблоты, иллюстрирующие воздействие инсулина на уровень pGSK3 (Ser9) и GSK3 в нейронах коры мозга крыс.

Кривая изменения уровня pGSK3 (Ser9) в нейронах коры мозга под влиянием инсулина после добавления прооксиданта не имела выраженных пиков (Рисунок 3.1.8), как было показано в случае активации Akt-киназы. Достоверное повышение уровня pGSK3 (Ser9)/GSK3 при добавлении инсулина наблюдалось с 30 мин после внесения H2O2 и сохранялось в течение 6 ч практически на всех изученных временных точках по сравнению с клетками, подвергнутыми воздействию только одной H2O2. Эти данные свидетельствуют об «ингибирующем» фосфорилировании GSK3 и, как следствие, инактивации этого фермента в условиях стимуляции клеток инсулином.

Антиапоптотические белки семейства Bcl-2 являются важнейшими регуляторами митохондриального пути апоптоза. Повышение их уровня и уменьшение отношения Bax/Bcl-2 способствуют увеличению выживаемости клеток, причем усиление Bcl-2-опосредуемых эффектов может быть следствием активации Akt-киназы (Zhao, Sapolsky, Steinberg, 2006). Однако до наших исследований сведения о стимулирующем влиянии инсулина на уровень Bax и Bcl-2 в динамике развития окислительного стресса в нейронах подробно не исследовались.

Нами показано, что 100 нМ инсулин в нейронах коры мозга без обработки H2O2 достоверно повышал экспрессию белка Bcl-2 (на 35%, p 0.05 в сравнении с контролем) (Рисунок 3.1.9 (А), точка 0) и уменьшал отношение Bax/Bcl-2, оцениваемое по соотношению экспрессии белков Bax и Bcl-2 (на 26%, p 0.01 в сравнении с контролем) (Рисунок 3.1.9 (Б), точка 0). После добавления H2O2 уровень экспрессии Bcl-2 в нейронах постепенно снижался, и через 1-6 ч после начала воздействия прооксиданта это снижение сохранялось и составляло в среднем 0.70±0.18 усл. ед. (p 0.05) (Рисунок 3.1.9 (А)). Преинкубация со 100 нМ инсулином при всех изученных сроках достоверно повышала уровень Bcl-2 в нейронах, подвергнутых воздействию прооксиданта (Рисунок 3.1.9 (А)).

Отношение про- к антиапоптотическому белкам Bax/Bcl-2 достоверно увеличивалось (на 41%) в клетках уже через 30 мин после добавления H2O2 и сохранялось на высоком уровне на всем протяжении эксперимента (Рисунок 3.1.9 (Б)). Увеличение экспрессии проапоптотического белка Bax может приводить к значительному снижению жизнеспособности нейронов, которое опосредовано повышением проницаемости митохондрий для проапоптотических факторов вследствие транслокации Bax во внешнюю мембрану митохондрий (Zhao, Sapolsky, Steinberg, 2006). Преинкубация со 100 нМ инсулином нормализовала отношение Bax/Bcl-2, и этот эффект инсулина в нейронах в условиях окислительного стресса был статистически значим, начиная с 30 мин и до 6 ч после добавления H2O2 (p 0.05) (Рисунок 3.1.9 (Б)). Показанная нами нормализация отношения Bax/Bcl-2 может указывать на ассоциированный с изменением экспрессии белков Bcl-2 и Bax механизм антиапоптотического действия инсулина в условиях H2O2-индуцированного окислительного стресса.

Изучение влияния инсулина при интраназальном введении на активность сигнальных путей в коре мозга и гиппокампе крыс при двухсосудистой ишемии переднего мозга и реперфузии

Инсулин реализует свое защитное действие посредством модуляции работы сигнальных путей. Как и в экспериментах in vitro нами было исследовано влияние инсулина на степень фосфорилирования ключевых протеинкиназ, которые могут лежать в основе нейропротекторного действия инсулина в экспериментах на животных. Значительная активация Akt-киназы, определяемая по отношению pAkt(Ser473)/Akt, была показана при двухсосудистой ИР в коре мозга и гиппокампе крыс (p 0.01) (Рисунок 3.3.7).

Нижележащей мишенью Akt-киназы является GSK3. В коре мозга и гиппокампе крыс, подвергнутых ИР, содержание pGSK3(Ser9)/GSK3 было достоверно выше, чем в тех же структурах мозга ложнооперированных крыс (p 0.05) (Рисунок 3.3.8), что согласуется с показанной нами активацией Akt-киназы.

ЛО – ложнооперированные крысы, ИР – крысы, подвергнутые ишемии и реперфузии, ИР-Инс – крысы, подвергнутые ишемии и реперфузии и получавшие инсулин. Данные представлены как M ± m (n=7). Различия достоверны: – по сравнению с ЛО, p 0.01; # – по сравнению с ИР, p 0.05. Б – репрезентативные иммунноблоты, иллюстрирующие действие инсулина и ишемии-реперфузии на уровень pAkt(Ser473) и Akt в коре мозга и гиппокампе крыс.

Интраназальное введение инсулина в дозе 0.5 МЕ/животное способствовало увеличению в 1.4 раза отношения pAkt(Ser473)/Akt в гиппокампе по сравнению с группой, перенесшей ИР, (p 0.05), в то время как изменений в коре мозга не было выявлено (Рисунок 3.3.7). Однако при введении инсулина нами не было обнаружено вызываемого активированной Akt-киназой увеличения фосфорилирования GSK3. Напротив, в коре мозга крыс, перенесших ИР и получавших инсулин, было показано уменьшение содержания pGSK3(Ser9)/GSK3 (р 0.05) (Рисунок 3.3.8)

На следующем этапе проводилось изучение изменения экспрессии генов и содержания про- и антиапоптотических белков Bax и Bcl-2 при интраназальном введении инсулина крысам, подвергнутым ИР. В коре мозга крыс, подвергнутых ИР, наблюдали значительное уменьшение экспрессии генов Bax (в 1.8 раз) и Bcl2 (в 1.9 раза) по сравнению с группой «ЛО» (p 0.01) (Рисунок 3.3.9). Интраназальное введение инсулина нормализовало экспрессию гена антиапоптотического белка Bcl-2, не влияя при этом на экспрессию гена Bax в коре мозга крыс, подвергнутых ИР (Рисунок 3.3.9).

Методом иммунноблоттинга обнаружено повышение отношения Bax/Bcl-2 в коре мозга крыс в 2.1 раза и в гиппокампе в 1.5 раза при ИР по сравнению с группой «ЛО» (p 0.01) (Рисунок 3.3.10). При этом интраназальное введение инсулина нормализовало отношение Bax/Bcl-2 в обеих исследованных структурах мозга (p 0.01) (Рисунок 3.3.10), что сходно с описанным нами ранее антиапоптотическим действием инсулина in vitro при индукции окислительного стресса добавлением перекиси водорода на культуре нейронов коры мозга крыс.

Участие MAPK при ишемии и инсульте широко изучается, и показана их двойственная роль в регуляции выживаемости клеток после ИР (Sawe, Steinberg, Zhao, 2008). В наших исследованиях было показано увеличение отношения фосфорилированной к общей форме ERK1/2 в 2.4 раза в коре мозга крыс и в 1.8 раз в гиппокампе, что указывает на повышение активности фермента в этих структурах мозга при ИР (Рисунок 3.3.11). При введении инсулина уровень pERK1/2 / ERK1/2 в коре мозга крыс, перенесших ИР, оставался повышенным, тогда как в гиппокампе отмечено достоверное его снижение (Рисунок 3.3.11).

Активация AMPK при ИР рассматривается как один из возможных защитных механизмов, который запускается при недостатке энергетических субстратов. Достоверное увеличение отношения pAMPKa(Thr172)/AMPKa в коре и в гиппокампе крыс при ИР, свидетельствующее об активации фермента и показанное в нашем исследовании (p 0.05), согласуется с данными литературы (Li et al., 2010, Ramamurthy, Ronnett, 2012, Auciello et al., 2014). Однако интраназальное введение инсулина не приводило к изменению содержания фосфорилированной формы AMPKa при ИР (Рисунок 3.3.12 (А)).