Введение к работе
Актуальность проблемы. Огромный дефицит пищевого белка, проблема получения искусственной пищи делают задачу изучения метаболизма аминокислот весьма актуальной. Изучение ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, в настоящее время приобрело не только чисто научное, но и большое практическое значение, особенно с развитием методического арсенала инженерной эн-зимологии. Имеется в виду важное практическое следствие этих исследований: получение оптически чистых изомеров аминокислот и ряда дериватов некоторых из них путем микробиологического синтеза и полусинтетичёским путем, применяя для последней цели соответствующие иммобилизованные ферменты, а также такая перспективная отрасль, как биосенсоры.
Важность этих исследований связана, например, с актуальнейшей в настоящее время проблемой создания сбалансированных по аминокислотному составу кормов для животноводства. Известно, как высока доля незаменимой для млекопитающее аминокислоты L-лизша в подобных исследованиях. В связи с этим весьма актуальной становится и проблема создания экспрессных и точных методов определения концентрации аминокислот на всех стадиях их производства и применения. И очевидно, что при определении концентрации L-лизина, применение могут найти ферменты, участвующие в катаболизме лизина.
К числу таких ферментов, представляющих интерес как с теоретической, так и с практической точек зрения относится индуци-бельный фермент Іі-лизкн-2-монооксигеназа, катализкругаі'.й уникальный путь окисления L-лизина у бактерий видов Ps.fluorescens и Ps.put Ida. Это олигомерныЛ белок, обладающий аллоетерическим механизмом регуляции ферментативной активности и положительной кооперативность», отличающийся высокой специфичностью по отношению к Ь-лизшу. Последнее обстоятельство делает фермент в выспей степени привлекательным с точки зрения разработки методики ферментативного определения концентрации лизина в растворах.
Пель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлось изучение некоторых характеристик Ь-лнзмн-2-монооксиге-назц,- разработка метода и создание аналитіяеской скетелза для определения концентрации L-лизкка в растворах.
В задачу работы входило: 1) сканирование доступных штаммов микроорганизмов видов Ps. fluorescens и Ps. put Ida - потенціальних источников фермента и выбор продуцента г,-лизин-2-монооксиге-
назы; 2) выделение, очистка и исследование основных характер стик фермента; 3) получение активного иммобилизованного препар та фермента: 4) разработка методики определения концентрац L-лизина в биологических жидкостях на основе лизин-2-монооксиг назной реакции; 5) создание аналитической системы для экспрес анализа концентрации L-лизина, разработка методики определен L-лизина в промышленных условиях.
Научная новизна и практическая значимость работы: Вперв проведено исследование физико-химических и кинетических свойс очищенного фермента 1-лизин-2-моноокеигеназы из Pseudomonas р tlda. Получены новые данные, подтверждающие гипотезу о характе аллостерической регуляции фермента. Впервые получен активный и мобилизованный препарат лизин-2-монооксигеназы. Впервые для ан. литических целей использована монооксигеназа и показана принц пиальная возможность определения L-лизина в жидких средах: культуральной жидкости ферментеров, жидком концентрате лизина др.
В результате проведенных исследований осуществлен вьібі продуцента Ь-лизин-2-монооксигеназы. Разработана методика виді ления и очистки лизин-2-мокооксигеназы. Разработана новая мен дика определения L-лизина в культуральной жидкости. Создана пр< точная аналитическая система на основе иммобилизованной L-лизга 2-монооксигеназы для безреагентного определения концентращ L-лизина практически на любом этапе его получения. На приме] Ь-лизин-2-монооксигеназы показана принципиальная возможное: применения в аналитических целях аллостерических ферментов, о( ладающих кооперативными свойствами, что существенно расширяі список ферментов, пригодных для применения в биосенсорах. Крої того, возможно применение фермента в медицине, например, в кач< стве противоопухолевого препарата.
Апробация работы. Материалы работы докладывались на ІУ Mej дународном симпозиуме "Использование иммобилизованных ферменте для получения пищи и в медицине" (Таллинн, 1984), I и II РеспуС ликанских конференциях по проблемам физико-химической биологии биотехнологии (Ереган, 1984, 1986), У Всесоюзном симпозиуме і инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), Международном симпозиз ме "Ферменты в аналитике" (Ной-Бранденбург, ГДР, 1986), Междуне родном симпозиуме по аминокислотам (Ереван, 1986), Международнс симпозиуме "Химическая физика ферментативного катализа" (Тал линн, 1987), IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты для селі
ского хозяйства, гашіевой промышленности, медицины и научных исследований (Ереван, 1988), XIX конференции ФЕБО (Рим. Италия, 1989).
Испытания анализатора для определения концентрации L-лизкна проводились на Чаренцаванском, Трішольском и Обольсксм биохимза-водах, кафедре химической энзимологии МТУ, в Институте микробиологии пм.А.Кирхенстейна АН Латвии, Научно-исследовательском ин-ституте антибиотіжов и биотронсформащы (Росток, Чехословакия).
На базе анализатора "АРСА" на Чаренцаванском заводе "ЛИЭШ" внедрен лабораторный регламент определения лизина.
ПУ^5лик2.Ш511 по теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из зведеній, четырех глав (Т - обзор литературы, II - экспериментальная часть, III. IV - результаты исследований и обсуждение), выводов и указателя литературы. Работа галогена на 116 страницах машинописного текста и содсрігит 24 рисунка и 12 таблиц. Библиография включает 106 наименований литературных источников.