Неорганические полифосфаты и фосфат-аккумулирующий потенциал дрожжей Бреус Наталья Александровна

Введение к работе

Актуальность проблемы

Фосфор является жизненно необходимым элементом всех живых организмов, входя в состав важнейших органических соединений, в том числе нуклеиновых кислот, АТФ и других нуклеозидфосфатов, фосфолипидов, фосфорилированных белков, углеводов. Недостаточное количество этого элемента в среде обитания является неблагоприятным фактором, лимитирующим рост и развитие, а его отсутствие приводит к гибели организмов. В связи с этим важной стратегией выживания в изменяющихся условиях среды для организмов, является накопление резервов фосфорных соединений. Эти соединения отличаются разнообразием. Это могут быть органические фосфорные соединения, такие как фитин (Ca-Mg-соль инозитолфосфата) высших растений (Rasmussen et al., 2010; Gibson et al., 2010), фосфоманнан некоторых видов дрожжей (Hansenula capsulata) (Avigad and Kalina, 1979), тейхойевые кислоты клеточной стенки бактерий (Grant, 1979). Живые организмы, находящиеся на всех ступенях эволюции, от архей и бактерий до человека, содержат неорганические соединения фосфора: ортофосфат (P_i), пирофосфат (PP_i) и неорганические полифосфаты (полиР). P_i и пирофосфат являются субстратами и продуктами многих ферментативных реакций, поэтому необходимо поддержание их внутриклеточной концентрации на относительно постоянном уровне. Концентрация пирофосфата у большинства организмов поддерживается на невысоком уровне за счет высокой активности пирофосфатаз (Baykov et al., 1999). У некоторых микроорганизмов пирофосфат участвует в энергетическом обмене наряду с АТФ или даже в большей степени, чем АТФ (Baltscheffsky 1967; Baltscheffsky et al., 1966, 1992; Khmelenina et al., 2011).

Постоянство концентрации P_i в цитоплазме достигается за счет его накопления и резервирования в виде осмотически инертных соединений и компартментации в клетке. У некоторых бактерий обнаружены внутриклеточные включения, содержащие малорастворимые фосфаты магния и кальция, а также внеклеточные малорастворимые фосфаты, связанные с клеточной стенкой (Smirnov et al., 2005; Рязанова и др., 2007; Герасименко и др., 1999). В организме позвоночных значительное количество нерастворимого фосфата кальция (апатита) входит в состав костной ткани, где он выполняет структурную роль (Omelon et al., 2009).

Большинство микроорганизмов накапливают P_i в виде высокомолекулярных полифосфатов (полиР), линейных полимеров ортофосфата, соединенных богатыми энергией фосфоангидридными связями (Kulaev, 1979, Кулаев и др., 2005, Kornberg et al., 1999). Недавно показано, что и в костной ткани содержится относительно много полиР, которые непосредственно вовлечены в процесс образования апатита (Omelon et al., 2009).

Исследование биоразнообразия фосфорных минеральных соединений и способности микроорганизмов разных таксонов к поглощению P_i из среды представляет собой актуальную задачу, важную для понимания функций этих соединений в клетках и участия микроорганизмов в круговороте фосфорных соединений в природе. Кроме того, микроорганизмы эффективны в качестве модели для изучения стратегии образования фосфорных минеральных соединений в других живых организмах.

Актуальность изучения образования фосфорных минеральных соединений у дрожжей связана с проблемой приспособления этих микроорганизмов к избытку и недостатку фосфатов в среде, а также их участия в круговороте фосфора. Актуальность этой проблемы возросла в связи с загрязнением окружающей среды техногенными фосфатами. Потенциал различных видов дрожжей в качестве фосфат-аккумулирующих организмов малоисследован в отличие от бактерий. Кроме S. cerevisiae, только для трех видов аскомицетных дрожжей, выделенных из сточных вод с высоким содержанием фосфатов, продемонстрирована способность к поглощению значительного количества P_i из среды (McGrath and Quinn, 2000; Watanabe et al., 2008). Дрожжи, как эукариотические микроорганизмы, представляют собой базовую модель для получения новых знаний об обмене фосфорных минеральных соединений у эукариот.

Цели и задачи исследования

Целью работы была оценка фосфат-аккумулирующего потенциала дрожжей, относящихся к различным таксонам, а также изучение особенностей метаболизма неорганических полиР в клетках видов, наиболее эффективно накапливающих P_i.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить способность представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей поглощать P_i из среды в неростовых условиях и выявить среди них виды, обладающие наибольшим фосфат-аккумулирующим потенциалом.

2. Определить условия максимального поглощения P_i из среды клетками представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей.

3. Определить содержание и химический состав резервных неорганических фосфорных соединений у Saccharomyces cerevisiae и Cryptococcus humicola.

4. Выявить особенности локализации полиР в клетках дрожжей S.

cerevisiae и Cr. humicola при поглощении P_i из среды.

2+

5. Изучить влияние Mg на поглощение P_i, накопление и длину цепи полиР у S. cerevisiae и Cr. humicola.

6. Выявить различия в накоплении минеральных фосфорных резервов клетками представителей аскомицетных и базидиомицетных дрожжей.

Стратегия: Изучение поглощения P_i клетками дрожжей проводили в модельных условиях, позволяющих оценить необходимость отдельных компонентов среды для этого процесса. Для определения качественного и количественного состава фосфорных резервов использовали комплексный подход, включающий химический анализ минеральных фосфорных соединений, прижизненную окраску клеток специфическим флуоресцентным красителем на полифосфаты и методы электронной микроскопии.

Научная новизна работы

Впервые представители пяти видов базидиомицетных дрожжей и трех видов аскомицетных дрожжей протестированы на способность к поглощению P_i на минимальных средах. Обнаружено, что для исследованной выборки дрожжей способность к поглощению P_i не связана с их принадлежностью к аскомицетам или базидиомицетам. Показано, что наибольшим потенциалом по поглощению P_i из среды обладают аскомицеты S. cerevisiae и базидиомицеты Cr. humicola. Выявлены условия, обеспечивающие проявление высокой способности к аккумуляции P_i из среды у S. cerevisiae и Cr. humicola: клетки обоих видов дрожжей поглощают около 80% P_i (при концентрации 5 мМ) в минимальной среде, содержащей только глюкозу и сульфат магния. Поглощенный P_i накапливается в клетках S. cerevisiae и Cr. humicola преимущественно в виде полиР. Установлена существенная роль ионов магния в накоплении минеральных фосфорных резервов у дрожжей: уровень полифосфатов и средняя длина их цепи в клетках S. cerevisiae и Cr. humicola возрастали более чем вдвое в присутствии этих ионов. Впервые обнаружены изменения в структуре и локализации этих полимеров при их накоплении в неблагоприятных условиях, связанных с отсутствием источника азота, особенно выраженные в присутствии катионов магния: увеличение степени полимерности полиР, появление множества полиР - содержащих включений в различных компартментах клеток, в первую очередь в цитоплазме. На примере S. cerevisiae и Cr. humicola показано, что структура и локализация полиР существенно различаются у неродственных видов в одних и тех же условиях.

Научно-практическая ценность работы

Даная работа относится к разряду фундаментальных исследований: полученные экспериментальные данные расширяют представления о фосфорном метаболизме эукариотической микробной клетки. Модельная система, разработанная для дрожжей, может быть использована для определения P_i-поглощающего потенциала различных микроорганизмов. Выявлены виды дрожжей, не уступающие по эффективности поглощения P_i известным в этом отношении бактериям из сточных вод. Дрожжи S. cerevisiae и

Cr. humicola представляют собоИ перспективные модельные микроорганизмы для изучения процессов фосфорной биоминерализации.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на ряде конференций: на 13^ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21^го века» (Пущино, 2009), 2^ом Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010) и Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011). По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Положения, выносимые на защиту

6. 1. Среди дрожжей, относящихся к разным систематическим группам, имеются виды, поглощающие неорганический фосфат из среды с эффективностью, сравнимой с таковой у наилучших фосфат-аккумулирующих бактерий, выделенных из стоков, загрязненных фосфатами. Эта способность обнаружена у дрожжей, относящихся к различным таксонам: наилучшим фосфат-аккумулирующим потенциалом среди проверенных видов обладают аскомицетные дрожжи S. cerevisiae и базидиомицетные Cr. humicola.

   2. Максимальное поглощение фосфата клетками S. cerevisiae и Cr. humicola наблюдается в среде, лимитированной по азоту, и стимулируется ионами магния. Модельные условия на основе лимитированных сред позволяют оценивать потенциал поглощения фосфата микроорганизмами.

   3. При избытке фосфата, достаточном количестве глюкозы в качестве источника углерода, и присутствии ионов магния происходит биоминерализация клеток дрожжей S. cerevisiae и Cr. humicola. Она выражается в накоплении преимущественно длинноцепочечных полифосфатов в виде цитоплазматических включений.

   Личный вклад

   Экспериментальная работа проведена лично Н.А. Бреус. Электронная микроскопия проводилась совместно с к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Конфокальная микроскопия проводилась в сотрудничестве с В.А. Яшиным (ИБК РАН). Микрорентгеновский анализ проводился совместно с В.В.

   Сорокиным (ИНМИ РАН). Флуоресцентная микроскопия проводилась совместно с к.б.н. В.В. Дмитриевым (ИБФМ РАН).

   Структура работы

   Диссертация состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Выводы", "Список литературы". Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста, включают 19 рисунков и 13 таблиц, список литературы включает 201 наименование.

   Похожие диссертации на Неорганические полифосфаты и фосфат-аккумулирующий потенциал дрожжей

   

   Изучение структуры и метаболизма отдельных фракций неорганических полифосфатов у дрожжей Saccharomyces сerevisiaeТрилисенко Людмила Васильевна

   

   Полифосфаты и экзополифосфатазы митохондрий дрожжей Saccharomyces cerevisiae Пестов Николай Александрович