Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Каталитически активные антитела 8
Искусственные абзимы 8
Природные абзимы 10
Абзимы-протсазы 11
Абзимы-нуклеазы ]2
Природные абзимы с другими активностями 19
Механизмы возникновения КААТ 20
Биологическая роль КААТ 22
Рассеянный склероз 24
Дезоксирибонуклеазы человека 26 І.З.І.ДНКазаІ 26
ДИКаза II 32
Фосфодиэстераза I 35
flHKasaDFF40 37
ЭндонуклеазаG 39
Лактоферрин 40
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42
РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ 42
МЕТОДЫ 44
Исследуемая группа больных рассеянным склерозом и группы сравнения 44
Получение сульфат-аммонийного осадка белков крови 44
Выделение антител крови аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose 44
Выделение антител из спинномозговой жидкости 45
Очистка IgG с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии 45
Аффинная хроматография IgG на ДНК-целлюлозе 45
Концентрирование препаратов белка 46
Определение концентрации белка 46
Электрофоретическйи анализ белков 46
2.2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивание
47 коллоидным раствором серебра
2.2.11. Иммуноферментное окрашивание IgG и их субъединиц 47
Синтез конъюгатов IgG кролика против легких и тяжелых цепей IgG человека с пероксидазой хрена
Проведение рН-шока для препаратов антител 48
Исследование взаимодействия ДНК-абзимов с аффинными сорбентами 49
Разделение молекул IgG с легкими цепями к- и І^-типа 49
Получение и очистка Fab-фрагментов IgG 49
Выделение ДНКазы I человека 50
Выделение ДНКазы II человека 50
Получение и очистка ДНК плазмиды pBluescript 51
Получение и очистка 5г-[ Р]-меченых олигонуклеотидов 51
Определение активности антител в реакции гидролиза ДНК плазмиды pBluescript
Экспресс-оценка ДНК-гидролизуюгцей активности антител 52
Определение активности ДНКаз в реакции гидролиза ДНК плазмиды pBluescript
Определение активности ДНКаз по Кунтшду 53
Исследование рН-зависимости реакции гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз
Исследование металл-зависимости реакции гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз
Исследование кислотолабштьности IgG-абзимов и ДНКаз человека 54
Исследование термостабильности IgG-абзимов и ДНКаз человека 55
Исследование гидролиза дезоксирибоолигонуклеотидов препаратами IgG и ДНКаз человека
Тестирование нуклеазпой активности к геле 55
Определение кинетических параметров реакции гидролиза олигонуклеотидов препаратами IgG
Определение активности антител в реакции гидролиза полирибонуклеотидов исСМР
Определение РНКазной активности антител в реакции гидролиза (pU)io методом кислотонерастворимых осадков
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 58
Выделение препаратов антител из крови человека 5 8
Скрининг ДНК-гидролизующей активности в препаратах антител 62
Доказательство наличия у антител крови больных рассеянным склерозом 69
каталитических функций
"Кислый шок" препаратов антител 70
Связывание ДНК-гидролизующих антител аффинными сорбентами 72
3.4. Получение высокое чищенных препаратов IgG из крови больных рассеянным
74 склерозом
Взаимодействие ДНК-абзимов с ДНК-целлюлозой 76
Выделение ДНКаз из мочи человека 78
Определение оптимальных условий гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз
80 человека
Исследование металл-зависимости 80
Исследование рН-зависимости 83
Сравнение рН- и термостабильности ДНК-абзимов и ДНКаз человека 87
Локализация активного центра ДНК-гидролизующих антител при рассеянном
89 склерозе
Определение типа легких цепей ДНК-абзимов 89
Каталитическая активность Fab-фрагментов IgG 91
Тестирование ДНК-гидролизующей активности антител in situ 94
Исследование гидролиза дезоксирибоолигонукяеотидов препаратами IgG и ДНКазами человека
Кинетические характеристики реакции гидролиза ДНК препаратами IgG 103
Сравнение субстратной специфичности препаратов антител и РНКаз 105
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
Введение к работе
Иммунная система высших организмов играет важнейшую роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды. Иммуноглобулины являются одним из основных специфических факторов иммунитета, направленных против чужеродного соединения, явившегося причиной их возникновения. До недавнего времени считалось, что результатом взаимодействия антиген-антитело (АГ-АТ) является формирование иммунного комплекса за счет нековалентных связей, а образование или разрыв ковалентяых связей невозможен. Исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать различные химические реакции. Теоретическое предсказание данного явления было сделано В. Джепксом в 1969 году [1], однако для практического подтверждения его гипотезы потребовалось не одно десятилетие. В настоящее время абзимология — область биохимии, изучающая каталитически активные антитела (КААТ), является интенсивно развивающимся направлением науки, а число известных примеров химических превращений, катализируемых абзимами, превышает сотню. Субстратная специфичность абзимов в ряде случаев выше, чем ферментов; описаны примеры КААТ, которые катализируют химические реакции с эффективностью, близкой к эффективности ферментов с аналогичной активностью. Более того, существуют примеры абзимов, для которых не известны ферменты с аналогичной активностью. В связи с этим, дизайн антител с заданной каталитической специфичностью имеет огромный спектр возможностей в биотехнологии и медицине.
Новые перспективы в области изучения КААТ возникли с открытием в 1989 году природных абзимов: аутоантитела к вазоактивпому интестинальному пептиду, полученные из крови больных бронхиальной астмой, не только связывали, но и эффективно гидролизовали данный пептид. Позднее, при ряде других аутоиммунных заболеваний, а также в молоке здоровых рожениц, были обнаружены абзимы с различными ферментативными активностями: протеолитической, ДНК- и РНК-гидролизугощей, амилолитической, ттротеинкиназной, нуклеотид-гидролизующей и некоторыми другими. Появление каталитически активных антител в крови человека связывают с протеканием в организме аутоиммунных процессов, когда происходит срыв толерантности к собственным антигенам и наработка антител к ним.
Рассеянный склероз (PC) - хроническое, прогрессирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), для которого характерна многофакторная природа и чрезвычайно гетерогенное клиническое течение. Основную роль в патогенезе PC играет
сочетание хронического воспалительного и не йроде генеративного процессов, сопровождающихся аутоиммунными реакциями. Хотя аутоиммунный ответ в основном направлен к компонентам миелииа - белково-липидной оболочке проводящих нервных волокон, в крови и ткани мозга больных также нарабатываются антитела к ДНК и нуклеопротеидньш комплексам, что указывает на возможность индукции каталитических анти-ДНКАТприРС.
Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе каталитических свойств антител с нуклеазньши активностями при рассеянном склерозе. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
провести скрининг ДНК-гидролизующей активности антител при рассеянном склерозе, а также при ряде других заболеваний и у здоровых доноров;
провести анализ РНК-гидролизующей активности антител при гидролизе различных субстратов;
доказать, что иуклешная активность антител является их собственным свойством;
локализовать активный центр на молекуле ДНК-абзимов;
изучить ферментативные и физико-химические свойства ДНК-абзимов (металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза, рН- и термосгабильность), а также провести их сравнение с соответствующим и характеристиками дезоксирибонуклеаз человека.
