Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обмен циклического аденозинмонофосфата и его регуляция 10
1.1. Биологическая роль сАМР 10
1.2. Свойства аденилатциклазы 12
1.3. Свойства фосфодиэстеразы 19
1.4. сАМР-зависимые протеинкиназы и фосфатазы фос-. фопротеинов 23
1.5. Специфика аденилатциклазной системы мышц . 27
1.6. Регуляция активности аденилатциклазы . 30
1.7. Регуляция активности фосфодиэстеразы 41
Глава 2. Особенности обмена веществ при физических на грузках 46
2.1. Метаболическая характеристика утомления . 46
2.2. Адренергический контроль обмена веществ при физических нагрузках 52
2.3. Биохимические механизмы адаптации к повышенной мышечной деятельности 56
2.4. Обмен циклических нуклеотидов под влиянием физической нагрузки 58
Экспериментальная часть
Глава 3. Материалы и методы исследований 62
3.1. Экспериментальные группы животных и реактивы 62
3.1.1. Экспериментальные животные 62
3.1.2. Характеристика физических нагрузок 63
3.1.3. Реактивы 63
3.2. Выделение субклеточных фракций 64
3.2.1. Выделение фрагментов саркоплазматического ретикулума 64
3.2.2. Выделение препаратов сарколеммы .65
3.2.3. Выделение фракции митохондрий 66
3.3. Определение активностей ферментов 66
3.3.1. Определение аденилатциклазной активности. 66
3.3.2. Определение фосфодиэстеразной активности. 68
3.3.3. Определение сукцинатдегидрогеназяой активности70
3.3.4. Определение АТРазной активности 70
3.4. Определение уровня сАМР .70
3.5. Определение белка 71
3.6. Определение сократительной активности миокарда тренированных крыс 71
3.7. Фармакологическая стимуляция МКЦ-адреналином 73
3.8. Фармакологическая стимуляция З-изобутил-1-ме-тилксантином 74
3.9. Корреляционный анализ экспериментальных данных 74
Глава 4. Результаты и обсуждение , 76
4.1. Субклеточное распределение и основные свойства аденилатциклазной системы скелетных мышц крысы 76
4.2. Влияние физической тренировки на сократительную активность миокарда и обмен.сAMP в скелетных мышцах и миокарде крыс 83
4.3. Изменения обмена сАМР в скелетных и сердечной мышцах в период восстановления после физической нагрузки 93
4.4. Влияние иммобилизованного адреналина на обмен сЖР и физическую работоспособность в восстановительном периоде после физической нагрузки 100
4.5. Влияние изобутилметилксантина на аденилатцик-лазную систему миокарда и скелетных мышц в восстановительном периоде после физической нагрузки
Заключение.. 123
Выводы 129
Список литературы 131
- Биологическая роль сАМР
- Метаболическая характеристика утомления .
- Экспериментальные группы животных и реактивы
- Субклеточное распределение и основные свойства аденилатциклазной системы скелетных мышц крысы
Введение к работе
В организме человека и животных биохимическими реакциями управляет нервно-эндокринная система, с помощью которой организм воспринимает различные воздействия внешней и внутренней среды и реагирует на них посредством гормонов. Биологическая роль последних заключается в реіуляпии важнейших функций организма: питание, рост, размножение, мышечная деятельность.
Ведущим фактором в реализации механизма биохимического действия гормонов, медиаторов и других биологически активных веществ является аденилатциклазяая система /213,1827, включающая такие компоненты, как аденилатциклаза, фосфодиэстераза,про-теинкиназы и фосфатазы фосфопротеинов /138,162,181,185,186,227, 230/. Под контролем этой системы находятся синтетические, биоэнергетические, транспортные процессы в мышцах, а также акт мышечного сокращения /113,120,182,205,223/.
Многочисленные данные литературы свидетельствуют и об участии аденилатциклазной системы в развитии адаптации организма к различным экстремальным воздействиям /12,38,55/. К одному из видов экстремальных воздействий относят длительную физическую нагрузку, которая сопровождается изменениями обмена веществ, в частности, углеводного и липидного /194,229,233/. Имеются также данные о сдвигах в содержании ряда гормонов, в частности, катехоламинов /їб-18,33/, оказывающих регудяторяое воздействие на внутриклеточный метаболизм через аденилатциклазную систему.
Механизм адаптации организма к длительным физическим нагрузкам во многом еще не изучен. В литературе имеются лишь единичные указания о состоянии отдельных компонентов аденилатцик- лазной системы /42,194/. Исследования по изучению состояния отдельных компонентов адеяилатциклазяой системы, проведенные на кафедре биохимии КГИФК и в Институте биохимии им. А.В.Паллади-на АН УССР показали, что физическая нагрузка, приводящая к утомлению, вызывает снижение содержания cAMP и повышение активности сАМР-зависимых протеинкиназ в скелетных мышцах /19,28/. Отсюда было высказано предположение, что аденилатциклазная ферментная система может иметь важное значение при адаптации организма к воздействию физической нагрузки.
Так, кратковременная физическая нагрузка сопровождается сильным /24-кратным/ увеличением содержания оАМР в миокарде, которое длится в течение суток, и лишь затем постепенно возвращается к исходному уровню. Активность фосфодиэстеразы с высоким и низким сродством к субстрату значительно увеличивается сразу же после упражнений, остается повышенной в течение последующих двух суток и возвращается к контрольному значению через 96 ч после окончания физической нагрузки. Увеличение активности фосфодиэстеразы наступает вследствие функционирования вновь синтезированных молекул фермента, а не активацией предсуществую-щих /167.
Более полной характеристики изменений в обмене сАМР в. восстановительном периоде после кратковременной физической нагрузки в литературе не обнаружено, также как и отсутствуют данные об аналогичных изменениях после длительных нагрузок.
Несмотря на очевидную важность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы в контролировании уровня сАМР в тканях животных в восстановительном периоде после физической нагрузки, систематическое и сравнительное изучение их свойств не проводилось.
Настоящая работа является первой в этом направлении»
Целью настоящей работы было изучение обмена сАМР и его направленной коррекции в восстановительном периоде после физической нагрузки» В связи с этим решались следующие задачи: I/ исследование субклеточного распределения и свойств аденилатцик-лазы и фосфодиэстеразн скелетных мышц крысы, 2/ сравнительное изучение изменений в обмене сАМР при мышечной деятельности различной интенсивности, 3/ изучение влияния физической тренировки на сократительную активность миокарда у крыс, 4/ исследование аденилатпиклазной системы скелетных мышц и миокарда в восстановительном периоде после физической нагрузки, 5/ изучение влияния иммобилизованного адреналина и З-изобутил-1-метилксан-тина - средств, направленно регулирующих метаболизм С.АМР скелетных мышц и миокарда.
Непосредственно после физической нагрузки аденилатциклаз-ная активность и уровень сАМР однотипно снижены как в скелетных мышцах, так и в миокарде, но в восстановительном периоде наблюдается противоположная направленность в изменении указанных параметров. Так в скелетных мышцах происходит длительное угнетение аденилатпиклазной активности и уровня oAMP, а в миокарде быстро развивается возрастание этих параметров с последующей нормализацией в отдаленной фазе периода реституции»
Изобутилметилксантин in vivo ингибирует фосфодиэстеразу в течение 3-6 ч и кратковременно активирует аденилатциклазу в обеих тканях»
Иммобилизованный адреналин и изобутилметилксантин нормализуют уровень С.АМР в ближайшей фазе восстановительного периода и существенно влияют на физическую работоспособность, более чем в 2 раза увеличивая продолжительность повторного бега предварительно утомленных животных.
Данные об обмене сАМР в скелетных мышцах и миокарде в восстановительном периоде после физической нагрузки, его направленная регуляция с помощью иммобилизованного адреналина и изо-бутилметилксантина, о влиянии изобутилметилксантина на адени-латциклазную систему in. vivo t а также о сократительной активности миокарда получены впервые. Они расширяют и углубляют представления о состоянии внутриклеточных регулярорных систем в восстановительном периоде после физической нагрузки и позволяют сделать вывод о повышении потенциальных возможностей аденилат-циклазной системы во внутриклеточной регуляции метаболизма скелетных мышц и миокарда.
Практическая ценность полученных результатов заключается в том, что они могут быть учтены при обосновании средств и методов регуляции биохимических процессов в мшщах и миокарде с целью повышения физической работоспособности организма.
Так как используемые в настоящее время тренировочные процессы достигли максимальной интенсивности и длительности, то с целью повышения эффективности тренировки, а также активации процесса восстановления прибегают к применению средств направленной регуляции метаболизма в мышцах. Поскольку их действие зачастую осуществляется через адеяилатциклазную систему, то изучение содержания oAMP, активности ферментов обмена данного нук-леотида позволяет более обоснованно применять новые препараты, вызывающие повыление физической работоспособности.
На официальную защиту выносятся следующие положения: однократная физическая нагрузка большой продолжительности сопровождается длительным угнетением в восстановительном периоде аденилатциклазной активности и уровня сАМР и активацией фосфодиэстеразы в скелетных мышцах, а в миокарде - длительным возрастанием всех трех параметров; после однократного введения в дозах, не оказывающих токсического влияния на организм, ЖЦ-адреналин нормализует в скелетных мышцах аденилатциклазную активность и уровень оАМР за 2-3 ч, а в миокарде препятствует падению аденилатциклазной активности и уровня сАМР и нормализует эти параметры через І ч после окончания физической нагрузки; изобутилметилксантин in vivo влияет на аденилатциклазную систему скелетных мышц и миокарда: более выраженное инги-бирование фосфодиэстеразяой активности отмечается в миокарде; обнаружена кратковременная активация аденилатциклазы в обеих тканях; влияние препарата на фосфодиэстеразную активность длится 3-6 ч; на фоне утомления изобутилметилксантин предотвращает повышение фосфодиэстеразной активности и быстро нормализует ее в скелетных мышцах и миокарде; оба препарата значительно увеличивают физическую работоспособность крыс; воспроизведение физической работоспособности или ее метаболических причин с помощью активаторов аденилатциклазы или ингибиторов фосфодиэстеразы является одним из доказательств участия уз -адреяергического механизма сопряжения в регуляции метаболизма при физических нагрузках.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическая роль сАМР
В ходе изучения механизма действия симпатомиметиков и глгокагона в тканях животных был открыт сАМР /212,213/. Это соединение было идентичным 3 ,5 -аденозияфосфату, синтезированному химическим путем Куком и Липкином /95/. сАМР является специализированным клеточным регулятором и не выполняет никаких иных функций /26/. Эффект специализированных регуляторов никогда не бывает прямым и нуждается поэтому в опосредующей системе:
I/ белковые рецепторы - первые и обязательно звенья реализации эффектов любых гормонов /99/;
2/ циклические нуклеотиды - вторые посредники большинства гормонов /212,213/;
3/ сАМР-связывагощий белок /І66/ у прокариотов и протеин-киназы /І38/ у эукариотов опосредуют действие сАМР через фосфо-рилирование соответствующих субстратов.
В бактериальных клетках сАМР играет роль сигнала голода и прямого стимулятора синтеза ферментов /Ї66/. С появлением простейших многоклеточных организмов сАМР сразу же занимает важное место в системе межклеточных взаимодействий. На первых порах он - сигнал поступающий из внешней среды /первичный мес-сенджер/, а при дальнейпей эволюции многоклеточных организмов - унифицированный внутриклеточный посредник в системе гормональной регуляции /вторичный мессенджер/.
В клетках высших организмов функция сАМР, как сигнала указывающего на дефицит энергетических ресурсов, сохраняется. Известно, что фтрессовых ситуациях, когда потребности в энергии особенно велики, клетки коры надпочечников активно выделяют в кровяное русло адреналин, который побуждает клетки печени к биосинтезу oAMP и через него - к усиленному распаду запасного питательного вещества - гликогена. В результате повышается содержание глюкозы в крови и тем самым покрывается дефицит в источниках энергии. Следовательно, функция с AMP как внутриклеточного сигнала голода остается прежней, но заключается в удовлетворении потребностей в энергии уже целого организма за счет его внутренних ресурсов. Следовательно, система циклических нуклеотидов филогенетически более древняя, чем нейрогормональ-ная система регуляции /222/. Однако у высших организмов более выражещЮ участие сАМР в реализации самых разнообразных, самых специальных проявлений клеточной активности /6/, а не его роль сигнала голода.
Клетка через циклические яуклеотиды воспринимает, усиливает и реализует нейрогормональяые влияния в своем физиологическом ответе /І2/. Установлено, что оАМР регулирует самые различные процессы, начиная от метаболизма целого ряда веществ и кончая такими фундаментальными проявлениями жизни как пролиферация и направление клеточной дифференпировки /221/. Наиболее интересным аспектом регуляторного действия сАМР является контроль фосфорилирования ядерных белков, т.е. непосредственный механизм регуляции генной экспрессии и клеточного деления ДЗ/.
Метаболическая характеристика утомления
Биохимические изменения в организме при утомлении, вызываемом различными по характеру физическими нагрузками, имеют ряд общих черт и существенных различий. К общим чертам относятся резкое снижение уровня АТР, активности миозиновой АТРазы,
2+
поглощений Са саркоплазматическим ретикулумом и снижением оптической плотности митохондрий, являющееся признаком их набухания и связанного с этим частичного разобщения дыхания и фосфорилирования /5/.
Различия же можно разделить на две группы. Первая - это параметры изменяющиеся однонаправленно, но под влиянием разных нагрузок количественно неодинаково, что относится к креатин-фосфату, гликогену мышц и печени, лак тату, пиру вату и мочевине крови. При кратковременных утомительных нагрузках содержание креатин фосфата снижается, а содержание лактата и пирувата возрастает более значительно, чем при многочасовых. При этом отношение лактат/пируват при кратковременных нагрузках резко возрастает. При длительной нагрузке оно сразу после нагрузки даже несколько снижается. Следовательно, кратковременные утомляющие нагрузки характеризуются значительно большей восстанов-леняостью системы NADH-NAD+ в цитозоле мышечных волокон, а после длительного утомления степень ее восстанавленности снижается. Содержание гликогена в печени в первом случае снижается существенно меньше, чем во втором, это относится и к гликогену мышц. Уровень мочевины и аминокислот в крови после длительной нагрузки возрастает больше, чем после нагрузок кратковременных.
Вторая группа параметров - это параметры, изменяющиеся разнонаправленно. Так, активность окислительных ферментов при кратковременных нагрузках не изменяется, а при длительных -резко снижается. То же самое можно отметить и в отношении активности гликогенфосфорилазы мышц и печени. Б первом случае активность фосфорилазы о- значительно возрастает /в печени не изменяется/, а фосфорилазы t сохраняется на уровне покоя. Во . втором случае снижается и общая ее активность, и активность фосфорилазы си . Общая активность гликогенсиятетазы мышц при кратковременных нагрузках не изменяется, а при длительной существенно снижается. Содержание белка митохондрий и СИР не изменяется / 5/.
Таким образом, характерными для обоих типов утомления являются прежде всего изменения, связанные с химизмом сокращения и расслабления мышцы /снижение содержания АТР, активности мио-зиновой АТРазы и возможностей поглощения Са СПР/, которые во всех случаях почти одинаковы. Параметры же, характеризующие степень нарушения биохимического гомеостаза /лактат, пируват, мочевина/, возможность ресинтеза АТР /креатинфоофат, активность окислительных ферментов/ и энергетический потенциал организма, его использование и восстановление /гликоген печени и мышц и основные ферменты его обмена/, изменяются в разной степени,придавая определенный специфический характер разным формам утомления.
Экспериментальные группы животных и реактивы
Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар массой тела 160-200 г, исследуя их в состоянии покоя, после различных типов мышечной деятельности и после фармакологической стимуляции. Ткани скелетной и сердечной мышцы фиксировали в жидком азоте. Препаративную работу вели при 0-+3С.
Подопытных животных делили на 4 группы:
I/ контрольные - нетренированные;
2/ тренированные, находящиеся в состоянии относительного покоя /животных этой группы декапитировали спустя двое суток после окончания тренировочной программы/;
3/ тренированные после физической нагрузки /животных этой группы непосредственно перед декапитацией подвергали физической нагрузке - бегу в течение 6 ч со скоростью 14 м/мин, после которой не наблюдалось явных признаков утомления, для контрольных эта нагрузка была предельной /Ї87;
4/ животные, подвергнувшиеся длительной однократной физической нагрузке до изнеможения при скорости бега 14 м/мин 3-6 ч. /в зависимости от массы тела животных/. В этой группе животных исследовали показатели в ближайшем /0-3 ч/, среднем /3-12 ч/ и отдаленном /12-48 ч/ восстановительном периоде после физической нагрузки, без фрамакологической стимуляции и с ней.
В качестве модели физической нагрузки был избран бег животных в третбане, так как он является распространенной и эффективной формой тренировки, вызывающей более значительные, чем плавание, адаптивные изменения в скелетных мышцах /І247.
Программа тренировки имела длительность 6 недель, в течение которых животных тренировали 5 дней в неделю. Скорость бега возрастала от 8 до 22 м/мин, а длительность от 10 до 120 мин.
Поскольку интенсивность и длительность тренировки постепенно возрастали, животные в течение первой недели пробегали 2608 м, второй - 6360 м, третьей - 12060 м, и каждой из трех последующих недель - по 13200 м. Всего за 6 недель тренировки крысы прибегали расстояние 60628 м при общем времени бега 49 ч.
В дальнейшем группы животных, подвергнутые предварительной тренировке обозначали общепринятым в литературе /617 термином "тренированные", подразумевая, что процесс тренировки животных и спортивной тренировки человека имеет большие различия.
Субклеточное распределение и основные свойства аденилатциклазной системы скелетных мышц крысы
Аденилатциклаза - мембранный фермент, большая часть активности которого сосредоточена в плазматической мембране клетки /102,197,214/. Кроме того, ее активность обнаружена и в других субклеточных структурах: в мембранах митохондрий скелетных мышц, мозга, коры надпочечников и семенников /21I/, а также в мембранах ядер печени крыс /204/. В сердечной мышце млекопитающих наиболее высокая активность аденилатциклазы во фрак-ции СПР, активно поглощающей Са и, судя по маркерным ферментам, не содержащей фрагментов митохондрий и сарколеммы /210/. Энгельгард и сотр. исследуя субклеточную локализацию аденилатциклазы в сердечной мышце обнаружили ее преимущественно в плазматических мембранах, но не в мембранах СПР /Ї08/. Гистохимическими и биохимическими исследованиями других авторов показано, что в СПР сердечной и скелетных мышц аденилатщклазная активность сосредоточена преимущественно в терминальных цистернах СПР /174/. Она обунаружена и в СПР скелетных мышц кролика /І737.
Фосфодиэстераза сАМР широко распространена в живом мире и тканях эукариот. В клетке фосфодиэстераза содержится в растворимом виде и в связанном - с различными субклеточными структурами, в частности митохондриями, микросомами и ядрами мозга и печени /92,203/. Наибольшая активность мембранного фермента наблюдалась во фракциях, обогащенных нервными окончаниями /230/. Показано, что в скелетной мышце человека наивысшая специфиче - 77 екая активность фермента приходится на СПР /Ї79/,
Нами были проведены исследования субклеточного распределения аденилатциклазы и фосфодиэстеразы в скелетных мышцах крысы для выбора наиболее оптимальных условий дальнейших экспериментов из-за отсутствия данных в доступной литературе.
При изучении локализации ферментов обмена с AMP в различных фракциях скелетных мышц крысы мы обнаружили наивысшую активность в сарколемме» При этом ферментативная активность 105 000 g осадка и общего гомогената в 2 и 4 раза ниже /таблЛ/. По нашим данным в СПР скелетных мышц аденилатциклазная активность незначительна и составляет всего 0,4-0,8% от общей активности фермента. Митохондрии и СПР скелетных мышц человека содержат 10-14% активности фермента /179/, в то время как те же фракции мышц крысы всего 3,3% /табл. I/.
Максимальную фосфодиэстеразную активность мы обнаружили в растворимой фракции в супернатанте 105 000 о и общем гомогенате /31,5 и 23,0% соответственно/, что указывает на наличие в скелетных мышцах крысы как растворимых, так и мембранносвязан-ных форм фермента. Существенная активность фермента сосредоточена также6105 000 g Ъадке и тяжелой фракции СПР /табл. I/.
Чистоту выделенных фракций мы оценивали по активности ферментов-маркеров /табл. 2/.
Похожие диссертации на Обмен сАМР в мышцах и его направленная регуляция в восстановительном периоде после физической нагрузки
