Содержание к диссертации
Введение
1. СОСТОЯНИЕ ПРОЕЖУ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 9
1.1. Опиатные рецепторы и их лиганды 9
1.1.1. Локализация опиатных рецепторов в органах и тканях 10
1.1.2. Гетерогенность опиатных рецепторов II
1.1.3. Природа и свойства опиатных рецепторов 15
1.1.4. Эндогенные лиганды опиатных рецепторов 17
1.2. Нейроендокринная регуляция иммунной системы 20
1.2.1. Механизмы нейрогуморальної! регуляции иммунной системы 20
1.2.2. Блеяние ненропептидов на функциональное состояние ишлунокомпетентных клеток 24
1.2.3. Значение опиоидных пептидов в регуляции иммунной системы 30
1.3. Эндокринная функция центральных органов иммунной системы 35
1.3.1. Иммунологически активные препараты химуса 35
1.3.2. Регуляторная: роль костного мозга 38
1.4. Цель и задачи исследования 42
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
2.1. Радиорецепторный метод 44
2.1.1. Получение препарата мембран клеток головного мозга крыс 44
2.1.2. Радиорецепторное тестирование 44
2.2. Очистка Н-мет-энкефалпна 49
2.0. Радиоыммунологическиы анализ 50
2.4. Реакция бласттрансформации лимфоцитов под действием фитогемагглютинина и митогена лаконоса 52
2.4.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека 52
2.4.2. Культивирование лимфоцитов и определение пролиферативыой активности 53
2.5. Материалы 54
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 56
3.1. Исследование способности веществ, входящих в состав гуморального фактора костного мозга и Т-активина, взаимодействовать с опиатными рецепторами 56
3.2. Радіадиммунологическое определение опиоидных пептидов в составе гуморального фактора костного мозга 65
Исследование влияния лигандов опиатпых рецепторов и фактора костного мозга на пролиферативную активность лимфоцитов 74
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
- Опиатные рецепторы и их лиганды
- Получение препарата мембран клеток головного мозга крыс
- Исследование способности веществ, входящих в состав гуморального фактора костного мозга и Т-активина, взаимодействовать с опиатными рецепторами
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Опиатные рецепторы и их лиганды
Специфическое действие -морфина и других наркотических анальгетиков на организм уже давно позволяло предположить, что взаимодействие опиатов с нервными клетками опосредовано специфическими структурами - рецепторами. В пользу этого предположения свидетельствовали следующие факты: во-первых, структурное сходство молекул морфина и синтетических наркотических анальгетиков, во-вторых, биологическая активность только левовра-щающих изомеров опиатов, в третьих, мощный анальгетический эффект, вызываемый некоторыми опиатами в очень малых количествах / H zr2Lt 7kscAjmaeA zs ,i9r7I/ .
Прямые доказательства наличия в организме оплатных рецепторов были получены с помощью радиорецепторного метода одновременно и независимо друг от друга сотрудниками нескольких лабораторий / Pe.i tf Smyclizh, Iс7о, Sinnoi zt сь/, Iу?о, 7bi- zH,us ,Iъ 7о/ , которые показали, что в центральной, нервной системе /ЦНС/ существуют места узнавания наркотических анальгетиков. Характеристики регистрируемого связывания меченых опиатов отвечали ряду требований, предъявляемых к связывающим местам рецепторной природы /Goldstein,,ISflbJ. Так, были показаны обратимость и насыщаемость специфического связывания опиатов с мембранами нейронов, высокое сродство связывающих мест к оплатам, корреляция между аффинностью специфического связывания наркотических анальгетиков с их фармакологической активностью I StaJJ zt ad,14111. важным доказательевом существования опиатных рецепторов было выделение их эндогенных лигандов - энкеи:алинов и эндорфинов.
В настоящее время существование опиатных рецепторов установлено у всех исследованных позвоночных и некоторых беспозвоночных животных /Булаев,1982/. Первоначально считалось, что опиатные рецепторы локализованы преимущественно в нервной ткани, т.к. наибольшие их количества обнаружены в ДЫС и в нервных сплетениях; кишечника морской свинки и семявыносящего протока мыши ///c/ jbes,I90I/. Развернувшиеся в последнее время исследования, направленные на поиск экстра церебральных оплатных рецепторов, существенно изменили эту точку зрения. На основе данных об изменении функционального состояния различных изолированных органов и клеток под действием опиатов представления о распространенности опиатных рецепторов значительно расширились. Удалось показать наличие этих рецепторов в ряде периферических тканей и органов. Так;, показано, что в почках опиоидные петиды повы шают активность орнитиндекарбоксилазы, причем этот эффект v блокируется налоксоном / Haddox,Kuss zll ,1979/. В жировой ткани опиоиды повышают активность фосфофруктокиназы, интенсивность Rizcta-k. ,1980/. Имеются также немногочисленные и противоречивые данные о влиянии лигандов опиатных рецепторов на функциональное состояние ижлунокомпетентых клеток /Лосева,Коляскина,1981, МуЬга at aJ ,1979, QilmcLh et «.ІЛ382, МсіСсьт at «1,1382/.
Получение препарата мембран клеток головного мозга крыс
В работе использовали крыс-самцов линии Вистар массой 200-250 г. Мембранную фракцию клеток головного мозга выделяли модифицированным МеТОДОМ S,inn xniov ct ctl /ISVO/.
Крыс декалитировали, мозг извлекали на холоду. Выделяли полосатое тело, гипоталамус и средний мозг по методике М// г/- zt аУ /1978/. Выделенную из 12 крыс ткань объединяли, взвешивали и гомогенизировали на гомогенизаторе типа Даунеа /стекло-тефлон/. Количество среды выделения составляло 50 объемов /по отношению к сырому весу выделенной ткани/. В качестве среды выделения использовали 50 мМ трис-НСІ буфер, рК=7,7, 2С. Гомогенат центрифугировали при 30 000 ft в течение 20 минут, 2С, на центрифуге ЪссМ-тап jZ s.i .Осадок ресуспендировэли в первоначальном объеме того яе буфера и инкубировали 40 минут при 37С для полной инактивации эндогенных опиоидных пептидов. После инкубации гомогенат повторно центрифугировали при тех яе условиях. Супернатант сливали, полученный" материал замораживали при -70С и использовали в течение 2 месяцев.
Гомогенат клеток головного мозга кхлгс после оттаивания повторно гомогенизировали и разбавляли 50 мМ трис-НСІ буфером, рН=7,7, 25С.
При радиорецепторном исследовании реакционная смесь объемом I мл содержала 50 мМ трис-ИС1 буфер, рН=У,У, 25С, 0,У мл мембранной суспензии /конечная концентрация беліса 0,8-1,tor/мл/, 100 мкл иН-морфина или иН-метиошш-энкефалина в конечной концентрации 4ыМ, 100 шел ингибитора протеаз бацитрацина в конечной концентрации 50 мкг/мл, 100 шел стандартного раствора соответствующего немеченого лиганда /в конечной концентрации от I до 500 нМ/ или 100 мкл исследуемого образца /САП - в конечной концентрации от I до 100 мкг белка/мл, Т-активин - от I до 100 гжг/мл/.
Величину специфического связывания определяли как разницу в связывании Н-морфина или Н-метионин-энкесиалина в присутствии и в отсутствии в реакционной смеси 2мкМ морфина или метионин-эн-кефалина соответственно. Определение уровня связывания проводилось в 3 параллельных пробах.
Исследование способности веществ, входящих в состав гуморального фактора костного мозга и Т-активина, взаимодействовать с опиатными рецепторами
На основе предположения о возможной роли нейропептидов, в частности, опиоидов, в опосредовании эндокринной функции тимуса и костного мозга было проведено радпорецепторное исследование влияния основных гормонов иммунитета па связывание меченых опиатов с мембранами клеток головного мозга крыс. Задачей, поставленной перед этой частью работы, было исследование наличия лигандов опиатных рецепторов в основных гормонах иммунитета: Т-активине, регулирующем процессы дифференцировки Т-лимфо-цитов, и в гуморальном факторе костного мозга САП, который участвует в созревании В-клеток /Петров,1982/.
Б качестве меченых лигандов опиатных рецепторов использовали Н-мет-энкефалин и ЧЧ-морфин, которые обладают различным сродством к и- и Ґ- опиатным рецепторам. Морфин является агонистом JA-рецепторов, глет-энкефалин предпочтительно взаимодействует с сГ-рецепторами /#« es,I98I/.
Проведенное исследование показало, что Т-активин /АФТ-6/ в конечной концентрации до 100 мкг/мл не изменяет уровень специфического связывания Н-мет-энкефалина /рис.3/ и Н-морфина /рис.4/ мембранами клеток головного мозга крыс.
Обсуждение результатов
Первоначально опиоидные пептиды были обнаружены в головном мозге /Hu s ,1975/ и гипофизе / Сол zt а/,1975/. Однако к настоящему времени показано, что эти вещества вырабатываются,1980/, в мозговом веществе надпочечников /L z-wis at aJ ,1982/, эндокринными клетками желудка, кишечника / Vola-k. /bloom ,1980/, поджелудочной железы / Vu0it z zncxhjo zL-сьі ,1980/ и в других тканях /Смагин и соавт. ,1983/.
В связи с этим обнаружение эндогенных опиатов в гуморальном факторе костного мозга/рис&,5/ ещё раз подчеркивает многообразие и универсальность биологических функций, осуществляемых опиатами, а также широкую распространенность клеток, синтезирующих эти вещества в организме.
Отсутствие в составе Т-активина /АУ/Г-Ь/ веществ, вытесняю-щих Н-морфин /рис.4/ и Ч1-мет-энкефалин /рис.3/ из опиатных рецепторов головного мозга крыс, не является доказательством того, что в тимусе не вырабатываются опиаты, действительно, предполагаемые опиоидные пептиды тимуса могли быть утеряны или разрушены в процессе выделения и очистки препарата /Арион,І98І/, в частности, на стадии аутолиза.
Отсутствие в Т-активине лигандов опиатных рецепторов ни в коей мере не доказывает отсутствие значения опиоидов в осуществлении эндокринной функции органов иммунной системы. Это лишь свидетельствует о разных механизмах действия гуморального фактора костного мозга САП и гормонов тимуса на шлмунокомпетентные клетки.
Радио рецепторное и радио иммунологическое определение ли-гандов опиатных рецепторов в составе САП позволило объяснить анальгетическое действие препарата и его тормозящий эффект на вызванные потенциалы в сенсомоторной области коры головного мозга /Петров и соавт.,1982/, а также обсудить некоторые возможные свойства исследуемых веществ.
Сравнение величин EC Q при вытеснении Н-морфина из рецепторов головного мозга крыс в присутствии и отсутствии в среде бацитрацина /50 мкг/мл/ показывает, что наличие в среде инкубации ингибитора протеаз почти в два раза повышает вытесняющую способность САП /рис.5/, причем сам бацитрацин не изменяет уро-вень связывания Н-морфина с опиатными рецепторами. Известно, что ряд опиоидных пептидов при инкубации с мембранамьг головно-го мозга подвергается частичному протеолизу, о чем свидетельствует увеличение уровня их связывания с рецепторами в присутствии бацитрацина / Нопотопа s zt oV,I98I, knighi , fc/ecz ,1979/. Б связи с этим, полученные данные /рис.б/ можно объяснить тем, что вытесняющую активность САП, по крайней мере частично, определяют опиоидные пептиды.
