Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одним из важнейших этапов развития различных тканей и органов является переход клеток от пролиферации к дифференцировке. В этот период начинается экспрессия многих специфических генов и синтез соответствующих белков, определяющих фенотип дифференцирующихся клеток. Существенным компонентом регуляции внутриклеточных процессов служит кальциевая сигнализация. Концентрация Са в цитоплазме регулируется путем высвобождения запасов данных ионов из внутриклеточных депо, однако стадия формирования этого механизма в ходе дифференцировки клеток неизвестна.
Для понимания формирования механизмов кальциевой сигнализации большое значение имеет изучение закономерностей строения и регуляции функционирования специфических ионных каналов, осуществляющих поступление Са в цитоплазму пролиферирующих и дифференцирующихся клеток (на модели миобластов). Молекулярная структура и экспрессия отдельных субъединиц кальциевых каналов установлена для многих типов клеток (Berridgt, Irvine, 1989; Авдонин, Ткачук, 1994; MacLennan, 2002; Зинченко, Долгачева, 2003; Rockman et al, 2002; Болдырев и др. 2006), однако для миобластов подобный анализ не проводился. Поэтому для понимания механизмов кальциевой сигнализации в миобластах установление структуры кальциевых каналов, а также регуляции их функционирования, предпринятое в нашей работе, является актуальной проблемой.
Существенную роль в процессах развития и восстановления мышечных
тканей играют адренергические рецепторы (Hinkle et al., 2002; Beitzel et al.,
2004; Lynch et al, 2007; Pearen et al, 2009; Duranti et al, 2011), однако данные о
характере их регулирующего влияния противоречивы. В связи с этим особый
интерес представляет сравнительное изучение роли адренергических
рецепторов в регулировании концентрации Са в цитоплазме
пролиферирующих и дифференцирующихся миобластов.
Цель и задачи работы. Целью работы было изучение механизмов кальциевой сигнализации в миобластах при их переходе от пролиферации к дифференцировке.
В работе были поставлены следующие задачи.
Изучить особенности регуляции внутриклеточной кальциевой сигнализации, вызывающей высвобождения ионов Са внутриклеточных депо, в пролиферирующих и в дифференцирующихся (в течение 24 час) миобластах.
Выяснить механизмы регуляции кальциевой сигнализации в
9+
пролиферирующих миобластах: выявить активатор поступления Са в цитоплазму этих клеток, а также рецепторы, на которые он воздействует; охарактеризовать каналы, через которые Са поступает в цитоплазму клеток, а также исследовать механизм передачи сигнала от рецептора к каналу.
Установить особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации, связанные с адренергическими рецепторами в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах.
Для установления специфичности потенциалзависимых кальциевых каналов в миобластах определить уровень экспрессии генов Cacnals, Cacnald,
9+
Cacnalc и Cacnalf, кодирующих синтез каналообразующих субъединиц Са -
каналов L-типа.
Научная новизна и практическая ценность работы
Впервые описаны особенности внутриклеточной кальциевой сигнализации в пролиферирующих и дифференцирующихся миобластах. Показано, что в пролиферирующих миобластах система, регулирующая концентрацию Са в цитоплазме путем высвобождения этих ионов из внутриклеточных депо, практически не функционирует, а ее формирование происходит в течение первых нескольких часов дифференцировки. Установлено, что поступление Са в делящихся миобластах осуществляется через потенциалзависимые Са -каналы L-типа. Эти каналы играют ключевую роль в регуляции концентрации Са в цитоплазме пролиферирующих
9+
миобластов. Механизм регуляции поступления Са включает в себя активацию
Рг-адренергических рецепторов, участие аденилатциклазы и поступление Са через потенциалзависимые Са -каналы L-типа. Показано, что после перехода клеток в состояние дифференцировки основным механизмом в регуляции концентрации Са в цитоплазме является высвобождение внутриклеточных запасов этих ионов. Впервые описано изменение уровней экспрессии отдельных субъединиц потенциалзависимых Са -каналов L-типа в миобластах в процессе их дифференцировки. Обнаружена нейрональная форма Са -канала L-типа Cavl.3 в пролиферирующих миобластах.
Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по клеточной биологии и биологии развития, а также учитываться в биомедицинских исследованиях при решении задач, связанных с патологиями, которые вызваны нарушениями кальциевой сигнализации и клеточной пролиферации.
Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи были решены с применением современных методов клеточной биологии, физиологии и молекулярной генетики. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных.
Апробация диссертации. Результаты исследования были представлены на XV школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008), конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2009, 2010), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009, 2011), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ в области биологических наук (Ульяновск, 2011)
Публикации. По материал диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 93 страницах. Работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение, выводы и список литературы; иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 74 источника, из них 7 отечественных и 67 иностранных.
