Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние годы характеризуются возрастанием интереса к исследованию организации метаболизма эукариотических микроорганизмов, в частности грибов и дрожжей, что обусловлено, с одной стороны, широким применением их в биотехнологии и необходимостью повышения эффективности их использования для создания более экономичного производства. В биотехнологии решается проблема утилизации непищевых субстратов для получения веществ, применяемых в разнообразных отраслях народного хозяйства. Важную роль в этом вопросе играют дрожжи, как организмы, способные при росте на таких субстратах, как углеводороды, спирты с различной длиной цепи, продуцировать белки, органические кислоты и другие продукты.
С другой стороны, гибкость метаболизма дрожжей, возможность четкого контролирования их культивирования, позволяет широко применять данный объект для изучения эукариотических организмов в целом.
В связи с этим возникает необходимость детального изучения структурно-функциональной организации метаболических путей ассимиляции и диссимиляции различных субстратов в клетках дрожжей.
В лаборатории окислительного обмена веществ ИБФМ АН РАН в течение ряда лет проводятся исследования организации метаболизма дрожжевых организмов при росте на жидких парафинах и глюкозе,а также этаноле. Показано, что на втором этапе окисления н-алканов действует не дегид-рогеназный путь окисления спиртов {Lebeault et at., 1970), а оксидаз-ный (Ильченко, 1984; Ильченко с соавт, 1987; Ильченко, Цфасман, 1988; Краузова с соавт., 1984; Краузова с соавт., 1985). Для дрожжей Yarro-wia lipolytica - продуцентов лимонных кислот, исследованы возможные пути окисления этанола (Ильченко с соавт., 1994), однако известно, что у дрожжей, как представителей эукариотических организмов, обмен веществ и энергии строго компартментализован, отдельные этапы метаболизма сопряжены с различными органеллами, что обусловливает необходимость изучения обмена не только в бесклеточных гомогенатах, но и в зыделенных компартментах. Для создания более полной картины участия гслеточных структур в обмене веществ и энергии рассматривали пути гревращения азота при использовании этанола в качестве единственного істочника углерода и энергии.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение путей и внутриклеточной организации окисления спиртов различной длины углеводородной цепи, , а также локализации азотного обмена у дрожжей Candida maltosa.
В задачи экспериментального исследования входило: .) изучение природы окисления коротко- и длинноцепочечных спиртов у
дрожжей С. maltosa;
-
определение субклеточной локализации ряда ферментов, в том числе начальных этапов окисления спиртов;
-
изучение азотного обмена в клетках дрожжей С. mattosa и У. tipoly-ttca при использовании этанола в качестве источника углерода.
Научная новизна работы. Показано, что в клетках дрожжей С. mattosa. выращенных на этаноле, функционируют два пути окисления спиртов: первый осуществляется НАД-зависимой алкогольдегидрогеназой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С2-С1г, локализованной в цитозоле; второй - алкогольоксицазой специфичной к спиртам с длиной углеродной цепи С6-С16, локализованной в пероксисомах. При росте же на длинноце-почечном спирте гексадеканоле функционирует только оксидазный путь.
При росте С.mattosa на этаноле обнаруживаются две альдегиддегидро-геназы, одна из которых локализована в пероксисомах и специфична к высшим альдегидам. Другая, локализованная в матриксе митохондрий и окисляющая ацетальдегид, нами выделена и охарактеризована.
Показана цитозольная1 локализация ацетил-КоА-синтетазы и предложена схема метаболизма алифатических спиртов в дрожжевой клетке.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработан метод очистки ацетальдегиддегидрогеназы, которая может быть использована для получения НАДН в реакции окисления ацетальдеги-да, т.к. и субстрат (этанол), и продукт реакции (ацетат) легко удаляются из реакционной среды.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на сессиях научных работ ИБФМ РАН 1990 и 1994 гг., на первой международной конференции по метаболизму Yarrowia lipolytlca в Тиверваль-Гриньоне, Франция (1995),
Публикации. По материалам работы опубликовано две печатные работы, одна статья принята к печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит 133 страниц машинописного текста, включая 1 таблиц, 2? рисунков. Список литературы содержит 24Д, источника (из них - 21$» зарубежные).