Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитохромоксидаза (ЦО ) - терминальный фермент дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий. ЦО катализирует восстановление кислорода цитохромом с, сопряженное с образованием ДдН*. Большинство терминальных оксидаз относится к так называемому гем-медному семейству, в котором на основании особенностей устройства протонных каналов выделяют классы А, В и С. К группе А принадлежат наиболее изученные оксидазы: ЦО митохондрий и многие бактериальные оксидазы. Они содержат три протонных канала (К, D и Н), для двух из которых (К и D) участие в переносе протонов доказано экспериментально. Терминальные оксидазы класса В исследованы в гораздо меньшей степени. Наиболее древними и хуже всего изученными являются оксидазы класса С. Оксидазы класса В появились в эволюции позднее, а самыми «молодыми» являются, по-видимому, оксидазы класса А. Сравнение эволюционно далеких друг от друга оксидаз важно для нахождения общих закономерностей, сохранившихся в процессе эволюции фермента, а значит, наиболее важных. Кроме того, оно позволяет определить особенности, связанные с адаптацией организмов (к высоким температурам, кислой среде и др.). Самым изученным представителем оксидаз класса В является ЦО типа Ъа3 из термофильной эубактерии Thermus thermophilus. Это единственная оксидаза класса В, для которой расшифрована трехмерная структура. Как и оксидазы класса А, фермент содержит три потенциальные протонные канала. Для одного из них прослеживается отдаленная гомология с К-каналом ЦО группы А, функциональная роль двух остальных пока не выявлена. Согласно работе (Kannt, 1998), оксидаза Ьа3 переносит протоны через мембрану с меньшей эффективностью (Н7ё = 0,5), чем оксидазы класса А (Н7ё = 1). В последнее
Список принятых сокращений: ЦО - цитохромоксидаза, КД - круговой дихроизм, МКД - магнитный круговой дихроизм, ДАД - 2,3,5,6-тетраметил-и-фенилендиамин, ТМФД -]М^,№,№-тетраметил-и-фенилендиамин, ФМС - феназинметасульфат, ЭДТА -этилендиаминтетраацетат, А|дН - трансмембранная разность электрохимических потенциалов иона водорода, А\|/ - трансмембранная разность электрических потенциалов.
время все больше указаний на то, что механизмы перекачки протонов через мембрану у гем-медных оксидаз разных классов могут различаться. Важно установить, коррелируют ли выявленные при анализе геномов различия в структуре протонных каналов с другими свойствами оксидаз, в первую очередь - с устройством центра восстановления кислорода. Традиционный подход к изучению кислород-редуктазного центра ЦО состоит в исследовании взаимодействия фермента с такими лигандами, как СО, HCN, H2S, Н2О2 и др., которые могут рассматриваться, как аналоги естественного субстрата, Ог (Koutsoupakis, 2002; Maramoto, 2010).
Цели работы. Целью настоящей работы являлось исследование особенностей устройства каталитического центра ЦО Ьа3 из Thermus thermophilus в сравнении с митохондриальной ЦО аоз-типа.
Основные задачи исследования заключались в том, чтобы: (1) сопоставить оптические характеристики гемовых центров оксидазы Ьаз из Т. thermophilus со спектральными свойствами оксидаз ааз типа; (2) изучить связывание окисленной оксидазы Ьаз с лигандами трехвалентного железа гема аз (цианидом, перекисью водорода, азидом); (3) изучить взаимодействие восстановленной ЦО Ьаз с цианидом и СО; (4) выявить наличие гемосопряженных ионизируемых групп в ЦО типа Ьаз', (5) исследовать возможную роль «кислородного канала» в проникновении лигандов в кислород-редуктазный центр оксидазы типа Ьаз.
Научная новизна и практическая значимость. Результаты исследования каталитического центра ЦО Ьаз из Т. thermophilus, изложенные в настоящей работе, получены впервые. Обнаружено, что цитохром Ьаз образует два разных цианидных комплекса с восстановленным гемом а-$, формирование которых определяется условиями восстановления фермента. При полном восстановлении в строго анаэробных условиях образуется комплекс, сходный с митохондриальным аналогом как сродством (Кд = 0,7 мМ), так и спектральными характеристиками. В присутствии слабых восстановителей гем аз образует с цианидом спектрально иной и практически недиссоциирующий
(Кд < 5*10" М) аддукт. Обнаружены также два типа комплексов оксидазы Ьаз с СО, один из которых, формирующийся в условиях частичного окисления, напоминает прочный цианидный комплекс. Впервые исследована кинетика взаимодействия KCN с восстановленной оксидазой Ьаз. Обнаружена рН-
2+
зависимость скорости связывания гема ат, с цианидом и показано, что связывание лиганда контролируется протонированием гемосопряженной ионизируемой группы белка с рКа около 9. Совокупность полученных данных свидетельствует о значительных различиях между ЦО классов А и В в отношении устройства кислород-редуктазного центра, что дает основания предполагать возможность различий в механизмах транслокации протонов оксидазами разных классов.
Апробация работы. Результаты докладывались на научном семинаре НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (2010), на 14-й (Москва, 2006) и 16-й (Варшава, 2010) Европейских конференциях по биоэнергетике, XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых международных журналах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 107 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 36 рисунков.
Похожие диссертации на Особенности устройства цитохромоксидазы ba3 из термофильной бактерии Thermus thermophilus
