Введение к работе
Актуальность проблемы
Апоптоз является одним из вариантов программированной гибели клеток. Он участвует в гистогенезе и поддержании гомеостаза организма. Нарушения процесса апоптоза приводят к развитию нейродегенеративных, опухолевых, аутоиммунных заболеваний. За запуск протеолитического каскада каспаза-зависимого апоптоза отвечают инициаторные и эффекторные каспазы. Среди них каспаза-3 является центральным ферментом апоптоза, так как на ней сходятся рецепторный и митохондриальный пути активации протеолитического каскада. В активном состоянии она инициирует активацию других эффекторных каспаз и гидролизует различные клеточные субстраты. Фермент представляет интерес как терапевтическая мишень при воздействии на клетку различных лекарственных препаратов, индуцирующих апоптоз. Уровень активности каспазы-3 является важным прогностическим маркером для оценки агрессивности патологических процессов и эффективности действия лекарственных средств.
Для изучения ферментативной активности в живых клетках в последнее время активно разрабатываются FRET-биосенсоры, в основе действия которых лежит метод индуктивно-резонансного переноса энергии. По изменению параметров FRET можно проводить прямой мониторинг ферментативной активности.
В настоящее время активно ведется разработка FRET-биосенсоров, где в качестве доноров и акцепторов используются флуоресцентные белки. Объединение нуклеотидной последовательности флуоресцентных белков и субстрата каспазы-3 в единой рамке считывания является основой разработки генетически кодируемых сенсоров каспазной активности. Индуктивно-резонансный перенос энергии в данных сенсорах проявляется как динамический тип тушения флуоресценции донора и, соответственно, характеризуется снижением времени жизни донора в возбужденном состоянии. Гидролиз линкера, содержащего аминокислотную последовательность DEXD, специфически распознаваемой каспазой-3, приводит к физическому разделению донора и акцептора, в результате чего условия переноса
Принятые сокращения: Трп-СП - триптофан в составе тербий-связывающего
Q_i_ Q_i_
пептида, Tb - ион тербия, ТЬ -СП - тербий-связывающий пептид, DsRed2 -красный флуоресцентный белок (Discosoma Red fluorescent protein), TagRFP -красный флуоресцентный белок (Red Fluorescent Protein), Tb -Cn-DEVD-DsRed2 -гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом
Q_i_
распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка DsRed2, Tb -СП-DEVD-TagRFP - гибридный белок на основе тербий-связывающего пептида, линкера с сайтом распознавания каспазы-3 и красного флуоресцентного белка TagRFP, FRET - флуоресцентный резонансный перенос энергии (Fluorescence Resonance Energy Transfer).
энергии нарушаются и, соответственно, снимается тушение. Данные сенсоры обладают преимуществами по сравнению с синтетическими флуорогенными субстратами. Это связано с тем, что генетически кодируемые сенсоры экспрессируются самой клеткой и не требуют внешней инъекции, кроме того они являются высоко стандартизованными метками со строго определенными точками присоединения белков друг к другу.
Для решения проблемы фонового сигнала клеток, связанной с автофлуоресценцией биомолекул и светорассеянием, разрабатывают сенсоры на основе белков со спектром флуоресценции в красной и дальнекрасной области. Другим подходом является использование в качестве доноров во FRET-nape флуоресцирующих комплексов лантанидов с микро- и миллисекундным временем жизни в возбужденном состоянии. При переносе энергии от донора-лантанида время жизни возбужденного состояния акцептора увеличивается на порядки по сравнению с естественным временем жизни флуоресценции. Перекрывание спектра флуоресценции тербия и возбуждения красных флуоресцентных белков создает условия для эффективного переноса энергии и последующего испускания микросекундной флуоресценции красным флуоресцентным белком. Использование спектроскопии с временной задержкой позволит избежать регистрации короткоживущего фонового сигнала клеток, что важно в условиях низкой интенсивности сигнала FRET-пары.
Цели и задачи работы
Целью данной работы являлась разработка генетически кодируемых сенсоров каспазы-3 на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Получение генно-инженерных конструкций, содержащих участки ДНК, кодирующие тербий-связывающий пептид, линкер с сайтом распознавания каспазы-3 и один из красных флуоресцентных белков DsRed2 или TagRFP;
Оптимизация условий синтеза, выделения и очистки гибридных белков до гомогенного состояния;
Изучение условий, при которых перенос энергии происходит максимально эффективно;
4. Изучение гидролиза полученных FRET-сенсоров каспазой-3.
Научная новизна
Q_i_
Впервые получены генетически кодируемых FRET-пары ТЬ -СП-DEVD-
Q_i_
DsRed2 и ТЬ -СП-DEVD-TagRFP на основе тербий-связывающего пептида и красных флуоресцентных белков DsRed2 и TagRFP, внутри которых происходят два индуктивно-резонансных переноса энергии: от тербий-связывающего пептида к
Q_i_ Q_i_
иону ТЬ , и от иона ТЬ к красному флуоресцентному белку. На основании изменений времени жизни ТЬ была рассчитана эффективность переноса энергии
Q_i_ Q_i_
от ТЬ к хромофору белка. Для белка Tb -Cn-DEVD-DsRed2 она составила 28%,
Q_i_
для белка Tb -СП-DEVD-TagRFP - 35%. Показано, что повышение ионной силы в
Q_i_
растворе приводит к снижению времени жизни ТЬ в возбужденном состоянии в
Q_i_
обеих FRET-napax. Белок Tb -Cn-DEVD-DsRed2, который по данным динамического светорассеяния является тетрамером, не гидролизуется каспазой-3,
Q_i_
в отличие от димерного белка ТЬ -СП-DEVD-TagRFP, который эффективно расщепляется каспазой-3 за исследуемые промежутки времени. Полученный FRET-
Q_i_
сенсор Tb -СП-DEVD-TagRFP может быть использован для изучения ферментативной активности каспазы-3 в живых клетках. Практическая значимость работы
Q_i_
Полученный FRET-сенсор ТЬ -СП-DEVD-TagRFP может быть использован для определения активности каспазы-3 in vitro.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были доложены на международной научной конференции International Symposium «Topical Problems of Biophotonics -2007» (Нижний Новгород-Москва-Нижний Новгород, 2007), на всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), на V съезде Российского фотобиологического общества (Московская обл., г. Пущино, 2008), на международной научной конференции II International Symposium «Topical Problems of Biophotonics - 2009» (Нижний Новгород-Самара-Нижний Новгород, 2009).
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 124 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 305 ссылок. Диссертация содержит 35 рисунков и 8 таблиц.
