Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств Колобов Алексей Александрович

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Колобов Алексей Александрович. Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.04 / Колобов Алексей Александрович;[Место защиты: ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет], 2017

Содержание к диссертации

Введение

1. Введение 7

1.1. Актуальность темы исследования 7

1.2. Степень разработанности темы 8

1.3. Цель 8

1.4. Методология и методы исследования 9

1.5. Научная новизна 9

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы 9

1.7. Положения, выносимые на защиту 10

1.8. Апробация результатов 10

1.9. Личное участие автора в получении результатов 11

1.10. Структура и объём диссертации 11

2. Обзор литературы 12

2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36 12

2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1 12

2.1.2. Структура генов ИЛ-36 13

2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36 14

2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов 15

2.1.5. Секреция ИЛ-36 17

2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36 18

2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1 20

2.1.8. Биологические функции ИЛ-36 21

2.2. Псориаз и цитокины группы ИЛ-36 22

2.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза 22

2.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза 23

2.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза з

2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия 27

3. Материалы и методы исследования 30

3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА 30

3.1.1. Штаммы бактерий 30

3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации 30

3.1.3. Электротрансформация клеток E. coli 31

3.1.4. Отбор трансформированных клонов 31

3.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E. coli 31

3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 34

3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 35

3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах 35

3.2.3. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в биореакторе (ферментере)

3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА 37

3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА

3.4.1. Флоккуляция 38

3.4.2. Кислотное фракционирование 38

3.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА 39

3.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow 39

3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow 40

3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S 41

3.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами к ИЛ-36РА 3.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте 41

3.5.4.2. Аффинная хроматография 42

3.6. Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА 43

3.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия 44

3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РА 44

3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114

3.10. Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа 45

3.11. Количественное определение ЛПС 46

3.12. Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах

3.12.1. Спектрофотометрическое определение 46

3.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой 46

3.12.3. Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА 47

3.13. Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест системы на основе клеточной линии А549 48

3.13.1. Культивирование клеток А549+36 48

3.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА 48

3.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА 49

3.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА 3.14. Искусственное окисление ИЛ-36РА 49

3.15. Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА 50

3.16. ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА

3.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА 50

3.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и окисленной форм ИЛ-36РА 51

3.16.3. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114 51

3.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА

3.17. Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощью капиллярного изоэлектрофокусирования 51

3.18. Динамическое светорассеяние 52

3.19. Статистическая обработка результатов 53

4. Результаты и обсуждение 54

4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств

ИЛ-36РА 54

4.1.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E. coli BL21[DE3] 54

4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-продуцентами безметионинового ИЛ-36РА 61

4.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА 66

4.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА

4.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов 70

4.1.4.2. Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобного дерматита на мышах 72

4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА 75

4.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА 79

4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе, исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА 79

4.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в лабораторном масштабе 79

4.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе 80

4.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА 84

4.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА 93

4.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производства 97

4.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и осветление лизатов методом флоккуляции 97

4.2.2.2. Масштабирование метода очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии 101

4.2.2.3. Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114 104

4.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии: материальный баланс 109

4.2.3. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в

масштабе пилотного промышленного производства 113

4.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА 113

4.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии 115

4.2.3.3. Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии: материальный баланс

5. Заключение 122

6. Выводы 123

7. Список сокращений 124

8. Список литературы 126

Теоретическая и практическая значимость работы

Рецептор ИЛ-36 устроен подобно рецептору ИЛ-1. Он состоит из внеклеточного домена, спирального трансмембранного домена, единожды принизывающего мембрану, и внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46, 133]. Внеклеточный домен содержит три Ig-подобных домена, связанных дисульфидными связями [150], что характерно для рецептов цитокинов семейства ИЛ-1 [136, 142]. Гликозилизование по Asn41, Asn234 и Asn250 критически важно для экстернализации рецептора, но не для связывания лиганда [150]. После присоединения к комплексу рецептор-лиганд корецептора внутриклеточные TIR-домены рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри клетки, такие как MyD88, IRAK1 или IRAK2, активируя NF- сигнальный каскад [42].

Несмотря на схожесть самих цитокинов групп ИЛ-36 и ИЛ-1 и их рецепторов, существуют различия в их механизмах рецепции. И в случае цитокинов группы ИЛ-1, и в случае цитокинов группы ИЛ-36 при связывании рецептора с лигандом образовавшийся комплекс привлекает корецепторную субъединицу IL-1AcP (IL-1 Accessory protein), общую для обеих групп [53]. При этом, если в случае ИЛ-1 рекрутирующее IL-1AcP взаимодействие происходит при участии молекулярной поверхности лиганда и конформационно изменившегося рецептора, то в случае ИЛ-36 боковые цепи лигандов не играют такой роли.

Области ИЛ-1, взаимодействующие с IL-1RAcP – это петли 4/5 и 11/12 (петля между 4 и 5 или 11 и 12 -складками, соответственно). Остатки Asp54 в 4/5 и Asp145 в 11/12 образуют водородные связи с Arg286 и Ser185, соответственно, в составе корецепторной субъединицы. В молекуле ИЛ-1РА петля 4/5 слишком коротка для взаимодействия с корецептором, а на соответвующей позиции в петле 11/12 находится положительно-заряженный Lys145, что делает невозможным прикрепление корецептора к лиганду [127, 142].

В молекуле в ИЛ-36 аминокислотные остатки на соответвующих позициях иные. Arg71 в 4/5 занят созданием связи внутри молекулы ИЛ-36, а на изгибе петли 11/12 находятся незаряженная аминокислота Ala162. А ИЛ-36РА больше структурно похож на ИЛ-1, т.к. имеет отрицательно заряженный Asp148 в 11/12, из-за чего у него изначально предполагали способность активировать рецептор [35]. Вероятно, при формирования комплекса ИЛ-36-рецептор-корецептор эти петли не играют той роли, что в случае ИЛ-1 [53]. По этой причине потерпели неудачу попытки создать химерную молекулу с повышенной деактивирующей рецептор ИЛ-36 активностью при замене этих петель в молекулах ИЛ-36 и ИЛ-36РА [53].

Несмотря на увеличение экспрессии генов ИЛ-36 при воспалении, секреция белков наблюдается не всегда [27, 163]. Причиной этого может быть то, что ИЛ-36 не содержат секреторного пептида, отщепляемого сигнальной пептидазой, их секреция происходит по неканоническому пути [123]. Это характерно и для прочих представителей семейства ИЛ-1, кроме ИЛ-1РА [135].

ИЛ-36 секретируется различными видами клеток в ответ на различные маркеры повреждения или инфекции. ИЛ-36 секретируется кератиноцитами в ответ на обработку кателицидином, антимикробным пептидом, уровень которого значительно повышен в коже при псориатическом воспалении [77]. Однако кератиноциты секретируют ИЛ-36 только в присутствии в среде АТФ, который считается маркером тканевого повреждения [163]. АТФ в среде также необходим для секреции ИЛ-1 [54]. Кератиноциты или эпителиоциты бронхов секретируют ИЛ-36 в ответ на обработку двуцепочечной РНК или её синтетическим аналогом полиинозин-полицитидиновой кислотой (pI:C). ИЛ-36 при этом выходит через разрывы в мембране, образованные под действием протеаз каспазы-3 и каспазы-7 - в результате пироптоза [27, 79]. Пироптоз отличается от апоптоза доминирующей активностью каспазы-1 и наличием активных инфламмасом. В случае апоптоза содержимое клетки, способное вызвать воспаление, изолируется в апоптотических тельцах. В случае пироптоза активные провоспалительных цитокины и другие маркеры тканевого повреждения выходят в межклеточное пространство, начинается воспаление [61]. Таким образом, ИЛ-36 может функционировать, в том числе, как алармин при вирусных инфекциях эпителиев [79].

Другие типы клеток способны секретировать ИЛ-36 иначе. Так, в ответ на бактериальную инфекцию ИЛ-36 секретируется макрофагами лёгких по Гольджи-независимому пути в составе микрочастиц и экзосом [69].

Помимо того, что было показано отсутствие сайтов гликозилирования у ИЛ-36РА [11], исследование пост-трансляционных модификаций ИЛ-36 до сих пор сводится, в основном, к вопросам их процессинга. Для получения полной биологической активности всем членам группы ИЛ-36 необходимо отщепление части аминокислот с N-конца молекулы [134]. Предположили, что процессинг ИЛ-36 происходит, как у прочих членов семейства ИЛ-1. В результате такого процессинга N-терминальным а.о. в последовательности остаётся а.о., расположенный на удалении в 9 а.о. от мотива A-X-Asp (где А – а.о. с алифатическим боковым радикалом) [4, 46, 134]. Экспериментально доказали, что биологическая активность процессированных таким образом ИЛ-36 возросла в 103-104 раз [134] (Рисунок 3).

Выравнивание аминокислотных последовательностей N-концов непроцессированных молекул ИЛ-36 относительно консенсусной последовательности A-X-Asp [134]. Стрелкой и красным цветом обозначен аминокислотный остаток, который должен остаться N-концевым в результате процессинга молекул интерлейкинов согласно гипотезе. В случае ИЛ-36РА для подобного процессинга достаточно внутриклеточной метионинаминопептидазы. В случае ИЛ-36, , процессинг происходит уже вне клетки с помощью катепсина G, эластазы и протеиназы 3, которые являются протеазами гранул нейтрофилов, поэтому процессинг и активация ИЛ-36 возможны только при дегрануляции нейтрофилов [56]. Однако, при таком процессинге ИЛ-36 отщепляется меньше а.о., чем было предсказано ранее (Рисунок 4). Биологическая активность ИЛ-36 при таком процессинге ниже, чем при отщеплении а.о. вплоть до 9 а.о. от мотива A-X-Asp [56, 134]. Протеазы, которые могли бы осуществлять такой процессинг ИЛ-36, пока не выявлены.

Контакт ИЛ-36 во внеклеточном пространстве с ферментами эластазой и катепсином G происходит не только в свободном межклеточном пространстве, но также в хроматиновых сетях, образующихся в результате нетоза нейтрофилов [28]. Нетоз (NETosis) – это процесс программируемой смерти нейтрофилов, при котором во внешнюю среду выходит хроматин нейтрофилов в виде сети с впутанными в неё молекулами антимикробных белков и протеаз. Этот процесс играет важную роль в иммунном ответе на бактериальную инфекцию [60] и развитии аутоиммунных заболеваний [20].

Процессинг с помощью протеаз нейтрофилов показан и для других членов семейства ИЛ-1. Так, ИЛ-1 и ИЛ-18 могут быть активированы вне клетки протеазами нейтрофилов, либо внутри клетки в инфламмасоме с помощью каспазы-1 [91]. ИЛ-37 процессируется каспазой-1 [70]. 2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1

Рецепторы всех цитокинов семейства ИЛ-1, кроме IL-18BP (IL-18 binding protein) и IL-1R8, устроены похожим образом. Они состоят из внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46]. После связывания лиганда с рецептором образовавшийся комплекс связывает корецептор. Внутриклеточные TIR-домены рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри клетки, активируя NF- сигнальный каскад [42].При этом используемые сигнальные пути общие для всех представителей семейства ИЛ-1 [122]. Такое дублирование эффектов обеспечивает амплификацию сигнала от патогенов без их диссеминации и генерализации местных эффектов воспаления [122].

При активации гетеродимерный рецепторный комплекс присоединяет к себе белок MyD88 и киназы IRAK, которые взаимодействуют с Е3 убиквитин-лигазой TRAF-6. Олигомеризация TRAF-6 активирует 2 альтернативных сигнальных пути, в которых участвуют различные MAPK киназы. В первом пути передача сигнала ведет к активации транскрипционного фактора NF-B [149]. Другой путь ведет к активации киназ JNK и p38 и транскрипционного фактора AP-1 [38]. В результате активации любого из путей запускается транскрипция генов различных медиаторов воспаления: ИЛ-6, ИЛ-8 и др. [29, 145]. ИЛ-1РА и ИЛ-36РА связываются с рецепторами IL-1R1 и IL-36R соответственно, но блокируют рекрутинг корецептора IL-1RAcP и передачу сигнала [122]. ИЛ-38 подобно ИЛ-36РА связывается с IL-36R и блокирует связывание рецептора с активатором ИЛ-36 [137].

Блокада действия ИЛ-1 также может происходить за счет действия рецепторов-ловушек [46]. Рецептор-ловушка IL-1R2 отличаются от обычного рецептора IL-1R1 укороченным TIR-доменом, что позволяет ему связывать лиганды, но не позволяет передавать сигнал. Он также существует в растворимой форме, что позволяет ему связывать лиганды и рекрутировать IL-1RAcP в растворе, таким образом не давая лигандам взаимодействовать с IL-1R1. При этом IL-1R2 взаимодействует с ИЛ-1 и ИЛ-1, но не с ИЛ-1РА [46].

Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов

После завершения создания штамма и перед началом его серийных культивирований был создан криоконсервированный эталон каждого штамма-продуцента ИЛ-36РА. Штамм, выращенный в ночной культуре в 1-кратной среде LB, рассевали штрихом на чашку Петри, содержащую 25 мл питательной среды 1-кратной среды LB с агаром. Чашку выдерживали в термостате при температуре +37 С в течение 18 часов, после чего просматривали, выделяли 10 типичных изолированных колоний (гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем). Выбранные колонии суспендировали в стерильной пробирке, содержащей 1 мл 0,15 М хлористого натрия, до получения равномерной суспензии и переносили в коническую колбу с 30 мл 1-кратной среды LB. Колбу помещали в термостатированную качалку при скорости перемешивания 250 об/мин и температуре +37 С на 18 часов. Из полученной культуральной жидкости стерильно отбирали 10 мл для контроля чистоты и стабильности культуры, а также качества плазмиды.

К оставшейся культуральной жидкости добавляли 10 мл 45% глицерина и перемешивали до получения гомогенной суспензии, которую затем разливали стерильной пипеткой по 1,5 мл в 20 стерильных пробирок и замораживали при -70 С.

На первом этапе работ созданные штаммы-продуценты ИЛ-36РА культивировали в колбах. Культивирование бактерий осуществляли в 1,5-кратной среде LB. В качестве селектирующего агента применяли ампициллин в концентрации 100 мкг/л. При культивировании штаммов, несущих две плазмиды, добавляли хлорамфеникол в концентрации 25 мкг/л. Культуру объёмом 10 мл в колбе объёмом 100 мл засевали, используя аликвоту криоконсервированной культуры, до плотности 0,1 ОЕ, растили 16 часов при +37 С при скорости перемешивания 250 об/мин. Затем культуру инокулировали в 200 мл 1,5-кратной среды LB, до плотности 0,3 OE и растили в колбе объёмом 2 л при +37 C до плотности 3 ОЕ/мл. После этого температуру понижали до +30 С и вносили индукторы: во все колбы – ИПТГ в концентрации 0,5 мМ, а при культивировании штаммов, несущих плазмиды pRh15A и pBAD15A, также рамнозу в концентрации 0,02% или арабинозу в концентрации 0,2%, соответственно. Длительность индукции составляла 3 часа. Биомассу бактерий собирали центрифугированием со скоростью 10000 g при +4 C в течение 30 минут и замораживали при температуре -70 С.

В дальнейшем при увеличении масштабов культивирования штамма Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf, pBAD15A) стали использовать биореактор BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) с ёмкостями 1 и 10 литров. Эти ёмкости специально сконструированы для масштабирования культивирования, они обладают аналогичными параметрами массообмена, отличающимися только количествами используемых материалов в 10 раз. В связи этим ниже описано только культивирование в ёмкости 10 л, как наиболее важной для работы.

Пробирку c криоконсервированной культурой штамма-продуцента ИЛ-36РА размораживали в термостате при +37 С в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки в стерильных условиях вносили поровну в четыре колбы вместимостью 2,0 л, содержащую 0,2 л 1,5-кратной среды LB, дополненной 1-кратной средой M9. Культуры растили в термостатируемой качалке в течение 18 часов при +37 С и скорости перемешивания 250 об/мин.

Ферментер BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) подготавливали согласно инструкции по эксплуатации. В сосуд помещали 6,5 л дистиллированной воды и 2 мл пеногасителя, герметизровали сосуд ватно-марлевыми пробками и фольгой. Сосуд ферментера стерилизовали в автоклаве в течение 30 минут при температуре +121 С и давлении 1 кг/см2. Вносимые далее растворы, кроме растворов антибиотиков, автоклавировали заранее в тех же условиях, что и ферментер. Растворы антибиотиков готовили в асептических условиях в стерильной посуде.

Автоклавированный сосуд ферментера помещали на станину и подключали к контрольному блоку. После запуска мешалки в асептических условиях в ферментер вносили 0,5 л 20-кратного раствора солей M9, 1,5 л концентрированной питательной среды, содержащей 247,5 г гидролизата казеина и 105 г дрожжевого экстракта, 5 мл 10% раствора магния сернокислого, 25 мл 0,4% раствора кальция хлористого, 10 мл 10% раствора ампициллина, 10 мл 2,5% раствора хлорамфеникола. Затем в сосуд ферментера вводили датчики рН и рО2, плотно герметизировали их втулками.

Через 5-10 минут доводили рН до 7,0±0,1 с помощью 25% раствора натрия гидроокиси или 20% раствора ортофосфорной кислоты. После этого включали подачу воздуха с расходом 4 л/мин, мешалку на скорости 200 об/мин и добивались установления стабильных показаний датчика рО2. После достижения заданной температуры и стабилизации показаний датчика принимали текущий уровень рО2 за 100%. В дальнейшем поддержание рН и аэрации проводилось автоматически в период всего процесса культивирования.

Затем в ферментер вводили посевную культуральную жидкость объемом 0,8 л через стерильную воронку в пламени спиртового факела при отключенной подаче воздуха. По окончании посева технологическое отверстие заглушали и подачу воздуха возобновляли в прежнем режиме. Через 1 час после начала культивирования, с интервалом в 1 час, отбирали пробы объемом 3,5 мл для измерения оптической плотности культуральной жидкости на спектрофотометре (длина волны 600 нм, толщина слоя в кювете 1 см).

По исчерпанию в среде глюкозы, что фиксируется защелачиванием среды культивирования и резким снижением потребления кислорода, вводили питательную добавку, содержащую 82,5 г гидролизата казеина и 35 г дрожжевого экстракта, объемом 0,5 л.

При достижении биореактором температуры +30 С вносили 5,0 мл раствора пеногасителя, 25 мл 1М раствора изопропил -D-тиогалактозида (ИПТГ) и 20 мл 20% раствора L-арабинозы. Все остальные параметры культивирования поддерживали на прежнем уровне. С периодичностью в 0,5 или 1 час контролировали динамику изменения оптической плотности. Через час и через 2 часа после введения ИПТГ в среду вводили по 8 мл 20% раствора L-арабинозы. Отсчет времени индукции начинали с момента ввода индуктора.

После истечения запланированного времени индукции биомассу штамма-продуцента ИЛ-36РА собирали с помощью проточной центрифуги Z-41 (СЕРА, Германия) на скорости 5000 об/мин при скорости подачи раствора 1 л/мин. Культуральная жидкость подавалась через стерильный шланг сливного штуцера ферментера при сохранении избыточного давления. Полученную биомассу замораживали при -70 С в чашках Петри. Вес получаемой биомассы составлял 270-300 г.

Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E. coli

Для сравнения эффективности отщепления N-концевого метионина от ИЛ-36РА и продукции ИЛ-36РА штаммами, несущими плазмиду с геном МАП, и штаммом E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) без плазмиды с МАП провели серию культивирований в колбах. Из полученных культур отбирали 3 оптических единицы плотности (ОЕ) культуры для определения количества ИЛ-36РА методом ИФА. Продукцию ИЛ-36РА рассчитывали как количество ИЛ-36РА на 1 л среды. Из получаемой бактериальной биомассы выделяли ИЛ-36РА хроматографически в две стадии. Первой стадией была негативная анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США), второй была гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Далее для ускоренного выделения ИЛ-36РА при определении доли его непроцессиованной формы применяли аффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными моноклональными антителами к этому белку.

В очищенном ИЛ-36РА примесь непроцессированной метиониновой формы определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. Коэкспрессия с МАП приводила к уменьшению примеси непроцессированной формы ИЛ-36РА. Все три штамма-продуцента, коэкспрессирующие гены ИЛ-36РА и МАП, производили ИЛ-36РА, содержащий 3% непроцессированной формы (Рисунок 16,17). Штамм-продуцент ИЛ-36РА, не несущий плазмиды с геном МАП, производил ИЛ-36РА, содержащий в среднем 25,6% непроцессированной формы цитокина (Рисунок 16).

Продуктивность штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) составила 186 мг ИЛ-36РА на 1 л бактериальной культуры (18,6 мкг/ОЕ) и оказалась несколько выше, чем у штаммов E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), однако отличие не было статистически достоверным (Рисунок 18). Достоверно ниже продукция ИЛ-36РА только у штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A) по сравнению с E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) (Рисунок 18). Причиной таких различий в продуктивности может служить более низкая эффективность наработки МАП под контролем промотора araBAD, чем в случае других использованных промоторов. Рисунок 16. Сравнение количества непроцесированной формы ИЛ-36РА в препаратах

ИЛ-36РА, полученных от различных штаммов-продуцентов E. coli. 36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). Иначе: 36RA/MAP-ara – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), 36RA/MAP-rha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкой указана достоверность отличий при P 0,05 (t-критерий Стьюдента)

Рисунок 17. Наложение типичных ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА, полученных при коэкспрессии с МАП (сплошная кривая) и без коэкспрессии с МАП (пунктирная кривая). Производительность штамма-продуцента E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), не несущего дополнительной кодирующей МАП плазмиды, была ещё выше и составляла 216 мг ИЛ-36РА на 1 л бактериальной культуры (или 21,6 мкг/ОЕ). Однако, отличие от штаммов E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) также не было статистически достоверным (Рисунок 18). Вероятно, дополнительная нагрузка на бактериальную клетку в виде необходимости поддерживать ещё одну плазмиду и синтезировать МАП приводит к снижению продукции ИЛ-36РА.

Рисунок 18. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммами-продуцентами E. coli.36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). Иначе: 36RA/MAP-ara – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), 36RA/MAP-rha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкой указана достоверность отличий при P 0.05 (t-критерий Стьюдента)

Существенным преимуществом полученной системы экспрессии безметионинового ИЛ-36РА является отсутствие дополнительных технологических этапов, связанных с обработкой МАП получаемого ИЛ-36РА после очистки. Самым существенным усложнением процесса являлась бы необходимость постоянной параллельной наработки высокоочищенной МАП. К тому же МАП является достаточно термолабильным ферментом, не подлежащим хранению в течение более 1 года даже при - 70 С. Кроме того, при масштабировании производства ИЛ-36РА потребовалось бы симметричное масштабирование производства МАП и введение дополнительных шагов в технологический процесс, связанных со сменой буфера в образце. По этим причинам коэкспрессия генов ИЛ36РА и МАП – и, таким образом, обработка ИЛ-36РА МАП in vivo – является более простым и экономичным способом получения безметионинового ИЛ-36РА, даже с учётом некоторого снижения его продукции.

Разработанная система коэкспрессии ИЛ-36РА с МАП в достаточной мере универсальна и может быть применена для получения и других рекомбинантных белков. Однако следует иметь в виду также и ряд ограничений этой системы, возникающих, главным образом, из-за природы самой МАП E. coli.Так, МАП обладает выраженной субстратной специфичностью: она может эффективно удалять N-концевой остаток метионина белковой молекулы только в том случае, когда следующий за ним аминокислотный остаток имеет радиус вращения своей боковой цепи не более 0,143 нм, как, например, остаток глицина или аланина[12].

Таким образом, очень неудачным объектом для МАП является, например, интерферон 2b человека, в молекуле которого есть замкнутая дисульфидная связь с остатком цистеина, следующим сразу за инциаторным остатком метионина [146]. Тем не менее, остаток цистеина в принципе имеет хиральный радиус бокового радикала, равный 1,22 ангстрем [76], т.е. процессинг молекулы с помощью МАП возможен, пока дисульфидная связь не замкнута. Эта ситуация вполне возможна в случаях, когда ИФН-2b производится в клетке в растворимом виде, а количество МАП в клетке достаточно для его своевременного процессинга, и когда рефолдинг и обработка ИФН-2b МАП проводятся in vitro.

Для обработки подобных сложных объектов получена модифицированная МАП с несколькими заменами в аминокислотной последовательности, способная игнорировать эти стерические ограничения[81]. Авторы утверждают, что примерно 85-90% известных белков могут быть процессированы этой МАП. Однако авторы также отмечают, что модифицированная МАП может отщеплять и следующий за остатком метионина аминокислотный остаток, если третий остаток в цепи имеет боковую цепь небольшого радиуса [81].

Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-продуцентами безметионинового ИЛ-36РА

Для осветления лизата был использован метод флоккуляции, основанный на добавлении в раствор двух солей, образующих при смешивании нерастворимый осадок. Частицы, взвешенные в растворе, становятся очагами кристаллизации, обрастают кристаллами соли, увеличиваются в размере и могут быть легко удалены центрифугированием. Метод обычно применяется для осветления культуральной жидкости суспензионных эукариотических клеточных культур [82]. Наиболее часто применяемая смесь - фосфат калия и хлорид кальция, которые образуют нерастворимый в воде фосфат кальция [82].

Клизату биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА добавляли при перемешивании фосфат калия до 20 мМ, хлорид кальция до 30 мМ, оставляли для формирования осадка на 1 час, осадок удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 1 часа (Рисунок 47). Уменьшение времени инкубации раствора после добавления солей до 30 минут или увеличение до 12 часов уменьшило эффективность флоккуляции – лизат хуже осветлялся. При этом при флоккуляции всё же теряется в среднем около 15% ИЛ-36РА (Рисунок 48).

Фотографии лизатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА на последовательных стадиях обработки. А – лизат до осветления, Б – лизат после осветления центрифугированием при 10000 g 1 час, В – осветлённый лизат при флоккуляции, Г – лизат после флоккуляции и повторного осветления центрифугированием при 10000 g 1 час.

Электрофореграммализатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА, полученных на различных этапах процесса флоккуляции: 1 – биомасса штамма-продуцента; 2 – лизат рН 7,0, растворимая фракция; 3 – лизат рН 7,0, осадок; 4 – лизат после флоккуляции, растворимая фракция; 5 – лизат после флоккуляции, осадок.

Таким образом, разработан метод лизиса биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА и осветления лизата методом флоккуляции, позволяющий обрабатывать за один прием биомассу от одного культивирования в 10 л биореакторе с потерями в среднем 27%. Получаемый лизат пригоден для дальнейшей хроматографической очистки ИЛ-36РА.

Процедура хроматографической очистки была масштабирована для обработки 2,5-3 литров лизата, полученного из 270-300 г биомассы штамма-продуцента за один цикл.

Были внесены изменения в первую стадию хроматографической очистки ИЛ-36РА -негативную анионообменную хроматографию на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США). До этого на колонку с 20 мл сорбента наносили осветленный лизат в 50 мМ буферном растворе трис-HCl, рН 7,0 и собирали несвязавшуюся фракцию. Назначение этой стадии - очистка раствора ИЛ-36РА от ряда примесных белков, ДНК и ЛПС, которые при рН 7,0 заряжены сильнее ИЛ-36РА и, в отличие от него, связываются сорбентом. Примеси затем смывали 2М NaCl в том же буферном растворе.

Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 300 мл. Для отмывки колонки сорбционный буферный раствор 50 мМ трис-HCl, рН 7,0 был дополнен 15 мМ NaCl. За счет этого достигалось меньшее размывание проходящей фракции, поскольку устранялось даже самое слабое взаимодействие ИЛ-36РА с сорбентом (Рисунок 49). После этой стадии хроматографии объем получаемого образца увеличивается на 30-40% по сравнению с исходным, а потери ИЛ-36РА составляют менее 5%.

Хроматограммы очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США). А – нанесение образца и отмывка раствором без NaCl, контрольная элюция 100 мМNaCl, регенерация 2 М NaCl; Б – нанесение образца и отмывка раствором с 15 мМ NaCl, регенерация 2 М NaCl.

Вторая стадия хроматографической очистки ИЛ-36РА на гидрофобном сорбенте Toyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония) также подверглась изменениям. Ранее она включала добавление к содержащему ИЛ-36РА элюату с Q Sepharose Fast Flow (GE, США) кристаллического сульфата аммония до 0,3 М и нанесение его на колонку с Butyl-650 S (Tosoh, Япония), уравновешенную 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 0,3 М сульфата аммония, pH 103 6,5, затем промывку 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 50 мМ сульфата аммония, pH 6,5 и элюцию градиентом отмывочного буфера и воды.

Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 200 мл. Методика пробоподготовки и нанесения проб осталась без изменений. Однако изменение параметров колонки сделано неэффективной градиентную элюцию ИЛ-36РА: не удавалось достичь разрешения между пиками примесей и ИЛ-36РА, достаточного для получения ИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ. Поэтому примеси и ИЛ-36РА стали элюировать ступенчато. Примеси удаляли промывкой 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 с 50 мМ сульфата аммония. Элюцию ИЛ-36РА затем проводили 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 без сульфата аммония. Регенерацию сорбента проводили водой. При этом, если при работе в меньшем масштабе удавалось и при регенерации сорбента водой получить некоторое количество высокоочищенного ИЛ-36РА, то теперь эта фракция содержала много примесей, и её стали отбрасывать (Рисунок 50).

Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографической очистки ИЛ-36РА насорбенте Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Дорожки: 1 – исходный образец (несвязавшаяся фракция с Q Sepharose Fast Flow), 2 – несвязавшаяся фракция, 3– отмывка отмывочным буфером, 4 –элюат,5 – хвост пика элюата,6 – регенерация сорбента.

Негативным эффектом масштабирования процесса стало резкое увеличение содержания ЛПС в образцах, полученных после второго этапа очистки. Это, по-видимому, связано со снижением эффективности первого шага очистки из-за большего насыщения ёмкости сорбента по сравнению с очисткой в меньшем масштабе. Разрешение на второй стадии очистки также снизилось, что сделало невозможным эффективное разделение ЛПС и ИЛ-36РА на гидрофобном сорбенте. Таким образом, возникла необходимость введения дополнительного этапа очистки, связанного с удалением ЛПС из образцов ИЛ-36РА.

Все методики, применяемые для удаления ЛПС из растворов, используют физико-химические свойства ЛПС – отрицательный заряд углеводного компонента или гидрофобность липидного компонента. Используются, в основном, хроматографические методики: анионообменная хроматография [26], хроматография на гидроксиапатитных сорбентах [43], гидрофобная хроматография [175], отмывка связанного с сорбентом белка раствором детергента [86, 109, 154] или органического растворителя [40], а также аффинная хроматография на сорбентах, на которых иммобилизованы селективно связывающие ЛПС лиганды, например, полимиксин[7].

Нами были опробованы все вышеперечисленные методы, кроме отмывания раствором детергента связанного с сорбентом белка, т.к. ИЛ-36РА невозможно сорбировать на анионообменные сорбенты без дезамидирования. Сорбция ИЛ-36РА на катионообменные сорбенты приводила к потерям более 50% белка. ИЛ-36РА высокогидрофобен, поэтому очистка его от ЛПС с помощью гидрофобных и аффинных сорбентов также приводит к большим потерям. Так, при пропускании образца ИЛ-36РА через колонку с С8-целлюлозой, потери белка составили почти 95%, а после сорбции на бутил-сефарозу (GE, США) белок элюировался вместе с детергентом. Подобные случаи описаны и для других белков [5]. Таким образом, ни один из опробованных хроматографических методов не позволил эффективно очистить ИЛ-36РА от ЛПС.

Альтернативой подходам к очистке от ЛПС, основанным на хроматографии, является т.н. двухфазная система с Triton X-114. В раствор белка, содержащий ЛПС, вводят детергент Triton X-114, охлаждают раствор до +4 С для увеличения растворимости детергента, затем раствор нагревают выше температуры помутнения этого детергента (+23 С). Растворимость детергента в воде критически снижается, и он образует мицеллы, в которые включается ЛПС. Мицеллы отделяются от раствора центрифугированием. Triton X-114 с ЛПС скапливается внизу пробирки в виде отдельной гидрофобной фазы, которая не смешивается с верхней водной фазой, содержащей белок [5, 24, 83].