Введение к работе
Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками (ферментами, антителами) и пептидами находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Иммобилизованные ферменты используются в качестве эффективных биокатализаторов в различных областях тонкого органического синтеза. Известно, что нестабильность некоторых белков ограничивает их широкое применение. Иммобилизация позволяет успешно решать проблему стабилизации белков, в том числе ферментов, а также многократно их использовать. Однако некоторые лабильные ферменты, например, тромбин или карбоксипептидазу В не удается иммобилизовать общеизвестными методами. Поэтому создание новых материалов и на их основе методов для иммобилизации нестабильных белков, в частности, ферментов становится все более актуальным.
В последнее время особое внимание исследователей привлекают так называемые «умные полимеры», которые способны изменять свои свойства или структуру в ответ на сигнал окружающей среды. При внешнем воздействии (рН, температура, химический сигнал, электрическое поле и др.) микроструктура таких полимеров быстро и обратимо изменяется от гидрофильного до гидрофобного состояния. Особенно привлекательны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению температуры или рН в физиологическом интервале, поскольку их свойства идеально подходят для иммобилизации различных биологически активных веществ (белков, пептидов, ДНК и др.). Введение "умных" полимеров в состав композитных матриц позволяет получать полимерные системы с заданными свойствами. Целью работы являлось создание комлозитных гидрогелей (в виде полимерных гранул и пленок) на основе синтетического термочувствительного полимера полн-N-вшшлкадролактама (ПВК) и альпшата кальция (CaAlg) с иммобилизованными в них белками, в частности, протеолитическими ферментами и пептидами; исследование свойств таких иммобилизованных систем и возможностей их примеиения в качестве биокатализаторов и для ускорения раяозаживления. Для достижения лоставленной цели предстояло решить следующие задачи:
получить гранулы (в том числе магнитные) композитного ПВК-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными в них протеолитическими ферментами;
разработать методы иммобилизации тромбина/пептидов в полимерные пленки композитного ПВК-CaAlg гидрогеля;
исследовать свойства протеаз, иммобилизовашшх в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля, в частности, рН- и температурную зависимости, термостабильность, устойчивость в различных водно-органических средах; определить кинетические
2 параметры ферментативных реакций при различных температурах и в различных водно-органических средах.
изучить возможность применения полученных гранул композитного гидрогеля с иммобилизованным в них химотрипсином в качестве биокатализатора в водно-органической среде (на примере реакции получения энантиомеров фенилалашша);
исследовать эффект полимерных пленок ПВК-CaAJg гидрогеля с иммобилизованными в них тромбином/пеггщдами на процесс заживления ран.
Научная новизна. Впервые получены стабильные в течение длительного времени препараты иммобилизованного тромбина. Изучен эффект полученных полимерных пленок с иммобилизованными в них тромбином и пептидами-агонистами тромбина и трипсина на процесс репарации тканей в экспериментах in vivo.
Создан новый эффективный бнокатализатор - химотрипсин, иммобилизованный в гранулы полимерного композитного ПВК-CaAlg гидрогеля. Исследованы свойства иммобилизоваппого химотрипсина, в частности, рН- и температурная зависимости, термостабильность и устойчивость в различных водно-органических средах. Впервые получены магнитные гранулы полимерного композитного ПВK-CaAlg гидрогеля о иммобилизованными протеолигическими ферментами. Для иммобилизованных в гранулы композитного ПВК-CaAlg гидрогеля протеаз, в частности, трипсина и химотрипсина, определены каталитические параметры при различных температурах и концентрациях органического растворителя.
Практическая значимость работы. Полученные в работе гранулы полимерного композитного ПВK-CaAlg гидрогеля с иммобилизованными ферментами (как магнитные, так и немагнитные), могут быть успешно использованы как биокатализаторы в различных химико-ферментативных реакциях, протекающих в водно-органических средах, в широком интервале температур. Показано, что полимерные композитные пленки на основе попи-N-винилкапролактама и природных полисахаридов с включенными тромбином/пептидами являются перспективными материалами, которые могут найти применение в терапии ран. Апробадия работы. Результаты диссертации были представлены на V (Потсдам, Германия, 1996), VI (Барселона, Испания, 1997) и VII (Тронхейм, Норвегия, 1999) Международных конференциях "Bioencapsulation"; на 7-ой Международной конференции по магнитным жидкостям (Плес, Россия, 1996); на IV Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997); на II Съезде российского биохимического общества, (Москва, 1997); на Ш Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Ялта-Гурзуф, Украина, 1997); на VIII (Будапешт, Венгрия, 1997) и DC (Брюссель, Бельгия, 1999) Европейских конгрессах по биотехнологии; на XVI Менделеевском съезде по общей и
прикладной химии (С.-Петербург, Россия, 1998); на II Международном семинаре РФФИ "Результаты фундаментальных нсследований в медицине и биотехнологаи для инвестиций" (Москва, 1998); на Международных конференциях "Биокатализ - 98" (Пущино, Россия, 1998) и "Биокатализ - 2000" (Москва, Россия, 2000); на XII Международном симпозиуме по микрокапсулированию (Лондон, Великобритания, 1999); па школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2О00); на 18-ом Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии: "Beyond the Genome: Understanding and exploiting molecules and cells in the third millenium" (Бнрмиигем, Великобритания, 2000); на 11-ом Международном симпозиуме по биотехнологии "Biotechnology 2000" (Берлин, Германия, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 24 печатные работы. Объем и струстура диссеитапии. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, изложенных в четырех главах, экспериментальной части, выводов, а также списка литературы, включающего 2*2.0 наименований. Диссертация изложена на 7<2& страницах машинописного текста, содержит ^.таблиц и ^рнсунков.