Введение к работе
і Актуальность темы. Известно, что интенсивная мышечная дея-
тельность (ИМД) сопровождается локальными повреждениями мышечных
волокон (Hagerman et. al. , 1983; Gutteridge, Hallivel 1990). При
этом в кровь выходят белки скелетных мышц (Kielblack et. al. ,
1979; Чайковский и др., 1987;). Влияние, которое оказывает ИМД,
сказывается не только на усилении выхода мышечных белков, но и на
их деградации. В данном процессе наряду с протеиназами собственно
мышц могут принимать участие и ферменты немышечного происхождения,
хотя данный факт не нашел еще своего полного подтверждения (Bird
et. al., 1980). В последние годы появились работы, указывающие на
появление лейкоцитов, в том числе нейтрофилов (НФ), в тканях
скелетных мышц (СМ) после ИМД (Armstrong et. al. , 1983). В мышцах
был обнаружен маркерный фермент НФ - миелопероксидаза (МПО)
(Цыпленксв, 1988). По-видимому, в данном случае можно говорить об
участии лейкоцитов в поддержании структурно-функционального гомео
стазе ткани СМ. Лейкоциты, вероятно, инфильтруют очаги ишемнчес-
кого повреждения мышц, возникающие в процессе усиленной мышечной
деятельности, и участвуют в их элиминации. При этом может иметь
место ' и поражение компонентами НФ нормально функционирующих
миоцитов.' Повреждение НФ ткани во многом зависит от действия
вырабатываемых этими клетками активных форм кислорода (АФЮ, а
также белков, заключенных в гранулах. Среди них в первую очередь
выделяют МПО, катионные белки и различные протеиназы, в частности,-
эластазу и катепсин G (Jaeschke et. al., 1992; Andersen et. al. ,
1993). Известно, что данные ферменты в ряде случаев могут не
только выступать в1 качестве защитных факторов организма, но при
увеличении их протеолитической активности они способны усиливать
воспалительные процессы, протекающие в тканях (Mendis et. al. ,
1990; Gabrielescu, 1992, ). Вполне вероятно, что попадающие в мышцы
после ИМД протеиназы НФ, включаясь в общий протеолиз, участвуют в
метаболических реанциях СМ в период их восстановления. В то же
время в тесном кооперативном взаимодействии с другими компонентами
НФ протеиназы могут оказывать повреждающее действие на мышечные
волокна. Настоящая работа посвящена изучению протеиназ НФ ткани СМ
после ИМД в качестве одного из факторов, определяющих повреждение
мышечной ткаки. ' . . '
- 4 -Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в исследовании влияния однократной ИМД на активность нейтральных протеиназ НФ в тканях СМ с. помощью антисыворотки (АС) к нейтрофилам, а такте изучение возможного влияния, оказываемого НФ, на мышечную ткань. Задачи исследования. 1. Получить АС к" НФ крыс. Отработать процедуру использования этой АС для снижения притока НФ в ткани СМ после однократной ИМД
-
Изучить динамику активности нейтральных протеиназ НФ в экстрактах смешанных СМ после однократной ИМД с помощью АС к НФ. В связи с чем определить условия для выявления активности нейтральных протеиназ НФ в СМ.
-
Изучить влияние АС к.НФ на активность нейтральных протеиназ в СМ различного типа метаболизма после однократной ИМД .
-
Исследовать динамику появления катепсина G НФ крыс в ткани СМ. В связи с чем выделить этот фермент из НФ и получить к нему антитела.
-
Исследовать in vitro воздействие НФ на СМ ш. soleus для оценки возможного участия НФ и их ферментов, в частности протеиназ, в повреждении миоцитов и деградации мышечных белков. Научная новизна и практическая значимость работы. Изучение
влияния однократной ИМД на активность нейтральных протеиназ в ткани СМ с помощью антинейтрофильной сыворотки выявило наличие протеолитической активности, принадлежащей протеиназам НФ. Введе-
ние крысам АС к НФ после ИМД способствовало снижению уровня активности нейтральных протеиназ в СМ задних конечностей.
Установлено, что однократная ИМД приводит к повышению активности нейтральных протеиназ, определяемой по гидролизу ФИТЦ-казеина, & мышечных волокнах с различным типом метаболизма. При этом введение АС к -НФ способствует снижению данной активности в
. мышцах как с гликолитическим, так и с оксидативным типом
,метаболизма.
Исследована динамика появления катепсина G (KG) НФ крыс' в СМ
. щ.-soleus. Обнаружено присутствие фермента- не только на разных
. атапах отдыха после НМД, но и в мышцах крыс, находившихся в
. состоянии покоя.
; Исследовано взаимодействие НФ с мышечной тканью га. soleus і л
. y.itro. Установлено, что в начальный период инкубации (1 ч)
..происходит увеличение активности мышечных ферментов креаткнкиназы
- 5 -(КЮ и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в инкубационной среде при совместной инкубации m. soleus и НФ. При дальнейшей инкубации имеет место подавление их активности. В этом процессе участвуют ферменты НФ - МПО и протеиназы.'
При инкубации га. soleus, изолированных из крыс, предварительно подвергнутых однократной ИМД и после введения им АС к НФ, обнаружен меньший выход мышечных ферментов КК и АсАТ, а также креатина в инкубационную среду в сравнении с мышцами, полученными из животных, которым АС К НФ не вводилась. При добавлении в инкубационную среду активированных НФ имеет место инактивация мышечных ферментов - КК и АсАТ и увеличение, выхода креатина.
Установлено, что при инкубации НФ с препаратами ферментов КК и АсАТ в большей степени подвергается инактивирующему влиянию со стороны НФ - КК. АсАТ - фермент, более устойчивый к повреждающему действию компонентов НФ.
Практическая значимость работы заключается в разработке флуо-риметрического метода и метода Вестерн-блотинга, позволяющих выявлять протеиназы, привносимые в СМ НФ, а также ' в получении препарата катепсина G, антител к катепсину G и АС к НФ крыс, что позволило создать методику не только для.выявления протеиназ НФ в СМ, но и для исследования участия. НФ в метаболических процессах, протекающих в мышцах в. восстановительный период после однократной ИМД Применение данных методов может позволить изучать воздействие НФ не только, на СМ, но и на другие ткани.
Положения, выносимые на защиту
1. Использование АС к НФ позволяет снизить содержание лейкоци-
тарных клеток в крови и' уменьшить их приток в СМ после однократной ИМД что обусловливает ее применение, для изучения влияния НФ на метаболизм СМ
-
Однократная ИМД вызывает увеличение активности нейтральных протеиназ в СМ. Снижение протеолитической активности под влиянием вводимой животным АС к НФ свидетельствует об определенном включении протеолитических ферментов НФ в общий баланс протеиназ СМ после однократной ИМД Обнаруженное присутствие катепсина G в тканях га. soleus как до однократной ИМД так и после нее может указывать на возможное участие протеиназ НФ в метаболических процессах, протекающих в мышцах.
-
Обнаруженное после однократной ИМД снижение активности нейт:
ральных протеиназ после введения АС к НФ имеет место как в гликолитических, так и в оксидативных мышечных волокнах. 4. Совместная инкубация m. soleus и НФ выявила увеличение активности КК и АсАТ в инкубационной среде. Более продолжительная инкубация мышц с НФ приводит к инактивации мышечных ферментов, КК и АсАТ. Подобное снижение активности ферментов в присутствии НФ вызвано деятельностью ферментов НФ, в том числе протеиназ. . Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на аспирантских конференциях научно- исследовательского института физической культуры Санкт-Петербурга в 1991, 1992 гг., всесоюзной конференции "Физическая работоспособность и питание", Санкт-Петербург, 1992, III международном конгрессе "Травма,, шок, сепсис", Мюнхен, Германия, 1994.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 4-х статьях и 1-х тезисах доклада.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа содержит 149 страниц машинописного текста, 14 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 211 наименований, в том числе 162 на английском языке.
