Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты и их ингибиторы играют важную роль в жизнедеятельности организмов.
Протеолитические ферменты широко применяются в пищевой промышленности, медицине, для скармливания в виде добавок к к< мбикормам животным (Мосолов, 1971; Вагонис, Тимука„, Трюкас, 1973; Веремеен-ко, 1971). Необходимость поисков протеиназ и ингибиторов протеиназ растительного происхождения, очечидна.
Особое внимание обращает на себя роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе пищеварения у человека и животных. Растительный иелок является важнейшей составной частью рационов полноценного питания. Однако, высокое содержание ингибиторов в некоторых растениях приводит к значительному снижению пищевой ценности продуктов. Присутствие таких продуктов в рационе питания приводит, в ряде случаев, к отрицательным физиологическим явлениям (Ge, Morgan, 1993).
Ингибиторы протеиназ обладают высокой термостабильностью и не разрушаются даже после кипячения (Chen, Mitchell, 1971). В некоторых случаях в результате термической обработки пищи ингибиторная активность резко повышается (Doell, Ebden, Smith, 1981). В результате ингибиторы протеиназ могут в существенной степени затруднять пищеварение белков. С другой стороны, находящиеся в растениях протеолитические ферменты стимулируют jtot процесс.
В связи с этим изучение содержания протеиназ и их ингибиторов в пищевых продуктах, а также исследование влияния этих веществ на пищеварительные протеиназы животных приобретает особое значение при разработке вопросов питания человека и животных.
Данные о содержании протеиназ и их ингибиторов в растениях, обна-
руженные нами в литературных источниках, являются неполными и касаются, в основном, представителей семейств бобовых, злаковых, пасленовых и тыквенных, реже ^ зонтичных и крестоцветных. Еще меньше литературных сообщений об активности протеаз и их ингибиторов в представителях семейств, объединяющих фруктовые растения. Известно ( Онивоги, 1986), что многие фрукты содержат значительное количество белка. Логично предположить, что эти растения обладают существенной активностью протеиназ и их ингибиторов. Так, по данным B.H.Doell, C.J.Ebden и C.A.Smith (1981), яблоки содержат до 67,7 мг ингибитора трипсина на грамм белка.
В литературе имеются данные о влиянии растительных ингибиторов бобовых, злаковых культур и картофеля на панкреатические пгютеиназы животных и человека (Belitz, Zynen, Weder, 1982; Rakowska et al., 1991). Bee эти растения употребляются в пищу после термической обработки, что, как правило, снижает уровень активности ингибиторов.
В большинстве работ, посвященных исследованию влияния растительных ингибиторов на панкреатические протеиНазы животных и человека, сравнивается ингибиторный эффект на активность протеиназ двух различных животных: карпа и быка (Хаблюк, 1983), толстолобика и быка (Зозуля, 1996), курицы и быка (Нечепуренко, 1997), человека и быка (Doell, Eb-den, Smith, 1981), человека и крысы (Krogdahl, Holm, 1983). Только в некоторых исследованиях изучалось влияние ингибиторов из растений на про-теиназы представителей сразу всех классов позвоночных животных (Проскуряков, 1969, Krogdahl, Holm, 1981). Результаты этих работ часто противоречивы.
Влияние протеиназных ингибиторов из растений на активность желудочных протеиназ человека и животных исследовалась очень слабо (Sakato, Та-naka, Misawa, 1975). Очевидно, эти исследования нуждаются в уточнении и расширении как в отношении растительных источников ингибиторов, так и источников панкреатических и желудочных протеиназ.
Результаты этой работы могут быть полезными при составлении рационов питания здоровых людей и больных с нарушениями пищеварения, а
также в кормопроизводстве. Неполная изученность содержания протеолитических ферментов и их ингибиторов в растениях, а также влияния ингибиторов протеиназ из растений на пищеварительные протеиназы человека и животных побудили нас к проведению этой работы.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование количественного содержания протеолитических ферментов и их ингибиторов в растениях, традиционно употребляемых в пищу в Краснодарском крае, а также определение влияния ингибиторов из этих растений на активность пзнкреатических и желудочных протеиназ различных позвоночных животных в целях поиска источников протеолитических ферментов, производства кормов, а также создания рационов питания для человека и животных. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать количество белка, активность трипсиноподобных, хи-мотрипсиноподобных, кислых и щелочных протеиназ, а также содержание ингибиторов трипсина, химотрипсина и пепсина в растениях, традиционно употребляемых в пищу в Краснодарском крае.
-
Определить динамику количества белка и активность вышеперечисленных биологически активных веществ исследуемых растений в процессе их онтогенеза;
-
Исследовать динамику содержания белка и активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в яблоках различных сортов при их хранении;
-
Определить термостабильность протеиназ и их ингибиторов, содержащихся в исследуемых растениях;
-
Исследовать влилние растительных ингибиторов на панкреатические протеиназы различных позвоночных животных;
-
Определить влияние растительных ингибиторов на пепсины различных позвоночных животных.
Научная новизна. Впервые систематически изучен большой спектр растений, употребляемых в пищу сыром виде и после термической обработки на содержание протеолигических ферментов и ингибиторов протеиназ.
6 Спорный вопрос об ингибиторах кислых протеиназ в растениях (пепсина) в
наших исследованиях нашел подтверждение: значительная часть изученных нами растений содержала ингибиторы пепсина. По спектру биологически активных веществ растения определены в 9 групп. Большинство растений находится в первых группах. Это свидетельствует о том, что, вероятно, все растения содержат все протеиназы и ингибиторы протеиназ, однако, количество их варьирует в представителях разных групп.
Исследовано влияние растительных экстрактов на общую казеиноли-тическую активность протеиназ, активность трипсинов и химотрипсинов различных позвоночных животных. Впервые определено влияние растительных экстрактов на активность пепсинов позвоночных животных всех классов.
Установлено, что при формировании зерен, бобов и орехов в них происходит увеличение содержания белка, количество белка в плодах, побегах и листьях, а также в плодовых телах грибов в процессе онтогенеза уменьшалось.
В процессе онтогенеза и хранения плодов, побегов и листьев исследованных растений происходит снижение количества белка, активности трип-синоподобных, химотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ и увеличение количества ингибиторов трипсина, химотрипсина я пепсина..
Теоретическая и практическая значимость работы. Все изученные растения разделены на группы по спектру обнаруженных в них биологически активных веществ. Предполагается, что все растения содержат исследованные биологически активные вещества, однако, количественное содержание их в растениях отличается. Проведено сравнительное изучение влияния растительных ингибиторов на протеиназы позвоночных животных всех классов: рыб, птиц и млекопитающих. Пищеварительные протеиназы позвоночных животных всех классов по-разному угнетаются ингибиторами из растений. Выявлены различия в действии ингибиторов протеиназ на ферменты жвачных и моногастричных животных позвоночных. Так, по степени влияния ингибиторов из сои на активность трипсинов животные распола-
гаются в следующем порядке: карп > толстолобик > судак > акула > курица > утка > свинья > крупный рогатый скот > овца > человек.
Полученные данные могут быть использованы при составлении рационов питания для людей с нормальным пищеварением и при лечении больных с нарушениями этого процесса.
Результаты работы могут быть также полезными при производстве искусственых кормов для сельскохозяйственных животных.
Кислые протеиназы и химотрипсиноподобные ферменты растении в перспективе могут быть использованы в молочной промышленности.
Высокое содержание протеиназ у бобовых культур (приблизительно на порядок ниже, чем в поджелудочной железе крупного рогатого скота) делает их потенциально пригодными для получения ферментов.
Ингибиторы протеиназ из исследованных растений могут быть использованы в качестве биоспецифических носителей при аффинной хроматографии.
Материалы диссертации могут быть полезными при чтении спецкурсов по специальности "Биохимия".
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Растительные продукты, входящие в рацион питания жителей Краснодарского края, содержат белок, трипсиноподобные, химотрипсиноподобные, щелочные и кислые протеиназы, а также ингибиторы трипсина, химо-трипсина и пепсина.
-
В различных сортах одного и того же вида растения находится разное количество белка, ферментов и ингибиторов.
-
В процессе онтогенеза плодов фруктов, побегов и листьев овощей, а также плодовых тел грибов наблюдается снижение количества белка. В процессе формирования бобов, зерен, орехов и плодов овощей, наоборот, происходит накопление белка. Уровень активности трипсиноподоб-ных, химотрипсиноподобных, щелочных и кислых протеиназ по мере развития всех исследованных анатомических частей растений понижается, а активность ингибиторов трипсина, хнмотрипсина и пепсина возрастает.
4. Динамика содержания белка, ферментов и ингибиторов в процессе онтогенеза отличается в зернах, бобах, орехах, листьях, плодовых телах и плодах.
-
При хранении плодов исследуемых растений в них происходит снижение количества белка и протеолитических ферментов и возрастание активности ингиСиторов протеиназ.
-
Ингибиторы протеиназ из исследованных растений в существенной степени угнетают активность панкреатических протеиназ позвоночных животных.
6. Экстракты изученных растений угнетают активность пепсинов
позвоночных животных.
-
Степень угнетения активности протеиназ зависит как от источника растительных ингиоиторов, так и от животного, используемого в эксперименте.
-
Ингибиторы протеиназ исследуемых растений обладают значительной термостабильностью, а протеиназы теряют свою активность при повышении температуры до 55-60С.
Апробация работы: Материалы диссертационной работы докладывали на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы водных экосистем и сопредельных территорий" (Краснодар, 1995), на Всероссийской конференции "Современные достижения биотехнологии" (Ставрополь, 1996), на межреспубликанской научно-практической конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных и центральных регионов России" (Краснодар, 1996), на межреспубликанской конференции "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий" (Краснодар, 1997), на 4-том симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997), на международном координационном совещании "Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных" (Воронеж, 1997).
» Публикация материалов исследования. По материалам диссертации
опубликовано б работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и возможностей практического приложения полученных результатов. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 13 таблицами. Список использованной литературы включает 288 источник, из них 142 на иностранных языках. Диссертация содержит 4 приложения.