Введение к работе
сгуалыюсть проблемы. Протон-транслоцирующая МАВН:убихинон-оксидоредуктаза ггохондрий млекопитающих или Комплекс I (КФ 1.6.99.3, NADH-дегидрогеназа, первый нкт сопряжения) - самый сложный компонент дыхательной цепи. Фермент, имеющий iccy около 1 млн. Да, состоит не менее чем из 42 различных полипептидов и содержит сколько редокс-комгонентов, потенциально способных участвовать в реакциях переноса ектронов и протонов: прочносвязанный FMN, по крайней мере 5 железо-серных астеров и не менее двух молекул прочносвязанного убихинона. Фермент в составе утренней мембраны митохондрий катализирует реакцию окисления NADH убихиноном и его водорастворимыми гомологами и аналогами, сопровождающуюся векторной анслокацией протонов:
NADH + Q + ІҐ + иН; <->NAD+ + QH2 + «Hc4 (1)
где Q и QH2 - окисленный и восстановленный эндогенный убихинон <3ю или его ібавленньїй водорастворимый гомолог, Н* и Н* - протоны, векторно перенесенные рез мембрану, а Н+ - «скалярный» протон, входящий в левую часть уравнения 1 [ADH - донор гидрид-иона, а хиноны - акцепторы водорода).
Величина стехиометрического коэффициента п (Н*/2е) в уравнении 1 является жнейшим параметром КАОН:убихинон-редуктазной реакции, так как любая модель ектрогенеза ферментом должна основываться на точно определенном значении и. сспериментальное определение стехиометрического коэффициента для Комплекса I -ожная задача. Методические подходы к решению этой проблемы были разработаны еще 60-х годах П. Митчеллом. Они основаны на измерении быстрореагирующнм рН-ектродом кратковременного изменения рН в анаэробной, слабозабуференной суспензии ггохондрий в присутствии субстратов окисления, к которой добавляют небольшие, чно известные количества («пульс») кислорода. При этом происходит кратковременное кисление среды инкубации, обусловленное протон-транслоцирующей активностью всей їхательной цепи (1ый, 2ой и 3й" пункты сопряжения). Суммарный коэффициент Н+/2ё и всей дыхательной цепи в таких опытах оценивают как отношение количества шедших из митохондрий протонов к количеству добавленного кислорода.
жрашения: СМЧ, субмитохондриальные частицы; БСА, бычий сывороточный ьбумин; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; FMN, флавинмононуклеотид; Qi, убихинон-DQ, децилубихинон; NEM, N-этилмалеимид; AjIHT, трансмембранная разность ектрохимических потенциалов ионов водорода; ДЧ*, электрическая составляющая дрН+
Измеренные или вычисленные величины Й+/2е для первого пункта сопряжения ПС данным литературы варьировали от 2 до 5. Предложенные различными авторами моделі протон-транслоцирующего механизма для Комплекса I основаны на этих величинах і представляют собой формальные спекулятивные схемы. Большой разброс і экспериментально определяемых значениях Н*/2ё прежде всего связан < невозможностью прямого измерения протон-транслоцнрующей активности Комплекса 11 составе традиционно использующегося для этих целей препарата интактных митохондрий Огчасти поэтому в настоящее время механизм векторного переноса протонов в первои пункте сопряжения неизвестен.
Реакция восстановления природного убихинона, катализируемая Комплексом І і составе дыхательной цепи, полностью (> 95%) чувствительна к специфически» ингибиторам убихинон-связывающего центра фермента - пиерицидину А и ротеноігу Считается общепринятым, что эти ингибиторы блокируют протон-транслоцирующук активность Комплекса I. Реакции Комплекса I с искусственными водорастворимым! гомологами или аналогами убихинона только частично (50-90% в зависимости от хинона акцептора и препарата фермента) чувствительны к пиерицидину А или ротенону.
По многим до сих пор известным параметрам взаимодействие ротенона Комплексом I вызывает те же изменения, которые происходят в структуре фермента прі его спонтанной деактивации - явлении, открытом в нашей лаборатории в начале 90-годов. Было обнаружено, что Комплекс I дыхательной цепи митохондрий млекопитающи существует в двух медленно взаимопревращающихся формах (активной деактивировашюй). Только активная форма фермента катализирует ротеної чувствительные реакции прямого (NADH-оксидаза и NADH.Qi-редуктаза) и обратног переноса электронов (аэробное, ДдН+-зависимое восстановление NAD+ сукцинатом). ] отсутствие субстратов окисления (NADH, NADPH) происходит спонтанная деактиваци фермента при температурах вышеЗСС. Это явление выражается в том, что препара катализирует ротенон-чувствительные реакции с отчетливой лаг-фазой и становите чувствительным к NEM. Деактивированный фермент становится полностью активны после одного или нескольких «активационньгх» оборотов (окисление NADH и медленнс восстановление убихинона). До настоящего времени вопрос о том, сопровождается л деактивация фермента потерей его протон-транслоцирующей активности, оставалс открытым.
Механизм функционирования Комплекса I представляется актуальной проблеме
современной молекулярной биоэнергетики. Кроме того, существуют многочисленнь
казания на непосредственное вовлечение дефектов Комплекса І в развитии различных атологай.
Цель настоящей работы состояла в разработке надежного метода регистрации и зучении протон-транслоцируїощей активности Комплекса І в составе дыхательной цепи рочносопряженных субмитохондриальных частиц и определении стехиометрического оэффициента Й*/2е для МАВН:убихинон-редуктазной реакции. Кроме того, редставлялось важным исследовать влияние специфических ингибиторов и деактивации юрмента на процесс векторного переноса протонов.
Научная новизна работы. Разработан метод регистрации транслокации протонов '.омилексом I в составе прочносопряженных субмитохондриальных частиц сердца быка, (пределен стехиометрический коэффициент для Комплекса І в НАОНіС^-редуктазной еакции, оказавшийся равным 4 Н+/2ё. Впервые показано, что при взаимодействии Іомплекса I со специфическими ингибиторами убихинон-связываюгдего участка (ротенон, иерицидин А, тритон Х-100) не происходит нарушений в протон-транслоцирующем іеханизме фермента. Показано, что структурные перестройки фермента, происходящие в езультате его термодеактивации, не влияют иа его протон-трапслоцируїошую активность.
Практическая значимость работы. Проведенные исследования расширяют редставления о механизмах транслокации протонов КАВН:убихинон-оксидоредуктазой. очное определение стехиометрического коэффициента реакции Й+/2е необходимо для азработки модели функционирования фермента. Подходы, применённые в данной работе, также полученные результаты могут использоваться при изучении функционирования ругих мембранных ферментов, осуществляющих векторную транслокацию протонов, езультаты данной работы используются при обучении студентов и аспирантов кафедры иохимии Биологического факультета МГУ.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на научных гминарах кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на II Съезде Биофизиков оссии (Москва, 1999), на 10 Европейской Международной Студенческой конференции ~ермания, Берлин, 1999), на Международной конференции «Митохондрии, клетки и ктивные формы кислорода» (Россия, Пушино, 2000), на 18 Международном Конгрессе по иохимии и Молекулярной Биологии (Великобритания, Бирмингем 2000.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 2 статьях и 7 тезисах окладов.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,
выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит стр. машинописного
текста, 7 таблиц и 35 рисунков. Список литературы включает 270 источников.