Введение к работе
Актуальность проблеммьг. Интерес к получению с помощью дрожжей веществ, химический синтез которых невозможен или нерентабелен, продолжает неуклонно расти.
Известно, что при ассимиляции ряда углеродных субстратов дрожжи могут экскретировать в среду органические кислоты (лимонную, изолимонную, пировиноградную, 2-оксоглутаровую, фумаровую и др.НФиногенова с соавт., 1966, Лозинов, 1970, Глазунова, Финоге-нова, 1973, Финогенова, 1982, Ермакова с соавт., 1986).
Использование тех или иных источников углерода для целей микробиологического синтеза ставит задачи изучения механизмов ассимиляции этих соединений, путей их превращения в конечный продукт и возможностей регуляции процессов биосинтеза.
Перспективным субстратом для микробиологического получения ряда вешеств является глицерин. Дрожжи Candida lipolytica при росте на глицерине способны накапливать в среде кетокислоты - пировиноградную и 2-оксоглутаровую. В ИБФМ разработан метод получения пировиноградной кислоты из глицерина с помощью дрожжей С.lipolytica (А.с. ы I32I064, N 1249069). Піровиноградная кислота является ценным биохимическим реактивом, а также может быть использована в качестве предшественника при производстве аминокислот - тирозина, аланина, триптофана, и лекарственного вещества диоксифе-нилаланин. Однако, метаболизм глицерина у дрожжей - продуцентов и механизм сверхсинтеза пирувата оставался неизученным.
Для изучения путей метаболизма глицерина нами были выбраны дрожжи с различным типом метаболизма: Candida lipolytica - строго аэробный организм, продуцент пировиноградной кислоты и Candida valida - культура, обладающая способностью к брожению, известный продуцент цитохрома с.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение ключевых ферментов путей метаболизма глицерина и механизма биосинтеза кетокислот у тиаминауксотрофных дрожжей С- lipolytica.
В задачи экспериментального исследования входило:
-
сравнительное изучение путей метаболизма глицерина у двух различных видов дрожжей - С.lipolytica и С.valida.
-
выделение и характеристика ключевых ферментов ассимиляции глицерина, исследование механизмов их регуляции;
-
изучение механизмов биосинтеза пировиноградной и 2-оксоглу-таровой кислот дрожжами С.lipolytica из глицерина.
Научная новизна работы. Установлен путь метаболизма глицерина у дрожжей C.lipolytica - продуцента кетокислот. Показано, что вовлечение глицерина в обмен происходит посредством его фосфорили-рования глицеролкиназой. Окисление образовавшегося глицерол-3-фос-фата в диоксиацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависи-мой глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы. Ключевой фермент этой метаболической последовательности - глицеролкиназа - очищен и охарактеризован.
Показано, что дрожжи C.valida реализуют другую метаболическую последовательность, в которой глицерин сначала дегидрируется глицеролдегидрогеназой до диоксиацетона, который далее фосфорили-руется диоксиацетонкиназой. Глицеролдегидрогеназа из C.valida выделена и охарактеризована.
Изучен механизм биосинтеза пировиноградной и 2-оксоглутаровой кислоты из глицерина дрожжами C.lipolytica при росте на дефицитной по тиамину среде. Проведен сравнительный анализ изменения активности ферментов основных метаболических путей при росте дрожжей на полной и дефицитной средах.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований создано представление о биохимическом механизме "сверхсинтеза" пирувата и 2-оксоглутарата, которое может быть использовано при практическом осуществлении процесса получения кетокислот.
Разработаны простые оригинальные методы очистки глицеролкина-зы из C.lipolytica и глицеролдегидрогеназы из C.valida.. Данные ферменты могут быть использованы для определения глицерина в микробиологической и медицинской практике. Способ получения глицерол-киназы из дрожжей защищен авторским свидетельством.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов", їига, 1986 г.; на Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов", Рига, 1987 г.; на Международной школе-конференции молодых ученых по микробиологии, Приморско, Болгария, 1987 г.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения в 7 главах,-выводов и списка литературы (1ъ1 ссылке). Работа изложена на Ч-Сї-страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 14 рисунков.