Введение к работе
Актуальность проблемы
Бактериальные препараты на основе рекомбинантных пробиотических штаммов, предназначенные для пероральной доставки пептидных стимуляторов роста в организм сельскохозяйственных животных, могут рассматриваться как эффективные и безопасные средства увеличения привесов. Одним из наиболее перспективных биоактивных пептидов для пероральной доставки является соматолиберин. Он обладает высокой устойчивостью к протеолизу и характеризуется низкими по сравнению с соматотропином (СТГ) и инсулиноподобным фактором роста (IGF) действующими концентрациями, что позволяет ожидать проявления его физиологического эффекта даже в условиях неэффективности проникновения из просвета кишечника в циркуляцию. Использование соматолиберина для решения практических задач в области зоотехнии в том числе, за счет синтезирующих его рекомбинантных штаммов, ограничивается фрагментарностью представлений о сигнальной роли этого пептидного гормона в регуляции роста и развитии организма, его фармакокинетике и клеточных мишенях. Есть данные о том, что в естественных условиях эффект соматолиберина дополняется действием его агониста PACAP (аденилатциклаза-активирующий пептид). В отличие от других позвоночных - птиц, рептилий и рыб, у млекопитающих GHRH и PACAP кодируются независимыми геномными генами (апоморфное состояние). В плезиоморфном варианте оба пептида транслируются в виде единого белка-предшественника с последующим процессингом, в результате которого в аппарате Гольджи клеток аденогипофиза образуются два отдельных физиологически активных пептида. Во всех опубликованных работах по исследованию биологического действия GHRH и PACAP эти пептиды были получены путём химического синтеза. В результате задача изучения сочетанного физиологического действия GHRH и PACAP не была поставлена и не решалась. Изучение естественной сигнальной функции соматолиберина осложняется тем, что его мРНК подвергается альтернативному сплайсингу. У птиц GHRH может являться продуктом одной из трех возможных сплайсоформ. В литературе полностью отсутствуют данные о возможности пероральной доставки производных соматолиберина, вызывающей, в частности, нарушение естественного распределения гормона в организме.
Практическое использование рекомбинантных штаммов бацилл, накапливающих в цитоплазме соматолиберин, в нестерильных условиях кишечника животных осложняется несовершенством экспрессионных систем поддержания чужеродных генов в этих микроорганизмах. Существующие плазмидные векторы не обладают достаточной репликативной и физиологической стабильностью. Кроме того, введение в организм сельскохозяйственных животных внехромосомных генетических элементов нежелательно с точки зрения биобезопасности. Наконец, системы контроля секреции, созревания и деградации гетерологичных белков в культурах бацилл изучены недостаточно, что нередко приводит к денатурации и деградации синтезируемых продуктов. Этому способствует высокая собственная протеолитическая активность бацилл. Таким образом, разработка метода получения рекомбинантного соматолиберина с помощью пробиотических штаммов потребовала решения целого ряда вопросов, связанных как с физиологической регуляцией действия соматолиберина, так и с разработкой систем экспрессии генов в клетках бацилл.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось доказательство возможности пероральной доставки соматолиберина с помощью живых бактериальных препаратов на основе рекомбинантных штаммов бацилл, несущих оригинальную интегративную генную конструкцию.
В соответствии с этой целью решались следующие задачи:
- Оптимизировать структуру гена соматолиберина для экспрессии в бактериях. На модели E. coli разработать систему измерения уровня накопления в бактериальных культурах и анаболического эффекта производных соматолиберина in vivo.
- Разработать интегративную генетическую систему, позволяющую экспрессировать производные соматолиберина свиньи в клетках пробиотического штамма Bacillus licheniformis B-4161.
- Получить опытный образец бактериального препарата на основе вегетативных клеток рекомбинантного штамма B. licheniformis B-4161, несущего ген соматолиберина и провести его биологические испытания на животных моделях мышей и поросят-отъёмышей.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые получен продуцент соматолиберина свиньи на основе пробиотического штамма B. licheniformis B-4161, сертифицированного для применения в животноводстве. При конструировании продуцента впервые показана высокая эффективность вновь сконструированной интегративной системы клонирования на основе промотора гена субтилизина клеточной стенки WprA и мини-гена устойчивости к эритромицину (Е-пептид). На модели мышей и поросят впервые экспериментально показана возможность достижения анаболического эффекта при пероральном введении млекопитающим двух видов (мыши и поросята) бактериального препарата, содержащего зрелую форму производного соматолиберина свиньи – пептидного гормона GHRH.
Искусственная стимуляция привесов сельскохозяйственных животных превратилось в существенный фактор сокращения себестоимости производства, её конкурентоспособности. Однако, изготовление очищенных белковых ростовых факторов парентерального применения, остается дорогостоящим и требует длительных сроков на разработку. Именно поэтому использование опасных для потребителя синтетических стероидных гормонов (производных тестостерона) животноводческими хозяйствами приобрело массовый характер. Внедрение в практику бактериальных препаратов на основе рекомбинантных продуцентов факторов роста на основе безопасных микроорганизмов, в том числе, бацилл является экономически эффективной и безопасной альтернативой использованию стероидов. Результаты работы могут быть непосредственно положены в основу новой технологии производства и применения рекомбинантных пробиотиков, обладающих анаболическим эффектом наряду с естественным защитным и профилактическим действием на патогенную микрофлору кишечника. Настоящая работа выполнена в рамках НИР по Государственным контрактам 16.512.11.2060, 14.740.11.1033, 14.740.11.0625, 16.740.11.0196, 14.740.11.0631 и 16.740.11.0027.
На защиту выносятся следующие основные положения
-
Предложена структура гена зрелого соматолиберина свиньи, пригодного для экспрессии в бактериях с образованием биологически активного пептидного гормона;
-
Показана принципиальная возможность пероральной доставки соматолиберина млекопитающим, разработана тест-система для биологического тестирования активности соматолиберина свиньи на мышатах-отъёмышах;
-
Разработана новая интегративная система на основе гена WprA, пригодная для высокоэффективной экспрессии гена соматолиберина в бациллах;
-
Показан анаболический эффект соматолиберина, доставляемого в составе пробиотического препарата на основе рекомбинантного штамма Bacillus licheniformis, на поросятах отъемышах при отсутствии у них системных дисфункций.
-
Впервые показана эффективность вегетативных клеток бацилл и E. coli в качестве контейнера для переноса рекомбинантных пептидов через агрессивную среду желудка и двенадцатиперстной кишки, что позволяет разрабатывать технологии создания бациллярных пробиотиков не споровой формы.
Апробация работы и публикации
Результаты исследований были представлены на следующих научных конференциях: Всероссийская конференция молодых учёных и II школа им. Н.М. Эммануэля (Москва, 2006); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Конференция посвященная 90-летию Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (Москва 2009); Научная конференция Доминикана (13-22 апреля 2012 г): материалы конференции опубликованы в журналах РАЕ: «Международный журнал экспериментального образования» №4, 2012 и «Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований» №4, 2012. Диссертационная работа была доложена на заседании отдела нанобиотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» 7 марта 2013 г.
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы
