Введение к работе
Актуальность
Важнейшим фактором прогрессии и роста солидных опухолей является неопластический ангиогенез, ключевую роль в регуляции которого играет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор II типа (VEGFR2) [Tong R.T. et al, 2004, Baeriswyl V. et al, 2009, Sia D et al, 2013]. VEGFR2 является основным медиатором VEGF-опосредованного сигнала в эндотелиальных клетках [Carmeliet P. et al, 2000], а также играет важную роль в трансдукции как при физиологическом, так и при патологическом ангиогенезе [Hicklin D.J. et al, 2005, Shibuya M., 2008, Silva S.R et al, 2011]. Во взрослом организме рецептор экспрессируется эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, эндотелиальными прогениторными клетками, мегакариоцитами и гаматопоэтическими клетками. Показано увеличение экспрессии VEGFR2 малигнизированными клетками различных типов солидных опухолей [Kranz A. et al, 1999, Dales J.P. etal, 2004, Seto T. et al, 2006, Ghosh S et al, 2008, Smith N.R. et al, 2010, Sia D. et al, 2013.], кроме того, в некоторых типах опухолей, например, при колоректальном раке, наблюдается повышенная экспрессия рецептора не только клетками опухолевых кровеносных сосудов, но и клетками лимфатических сосудов [Smith N.R. et al, 2010]. Все больше появляется данных, что интенсификация синтеза VEGFR2 ведет к повышению выживаемости опухолевых клеток в условиях постоянной гипоксии и может являться одной из причин развития химиорезистентности и образования более агрессивного фенотипа опухолей [Calvani et al, 2006, Yang F. et al, 2011, Chatterjee S. et al, 2013]. Поэтому VEGFR2, как основной рецептор трансдукции проангиогенного сигнала, может рассматривается в качестве перспективной молекулярной мишени не только для антиангиогенной терапии, но также как вектор для селективного транспорта наноразмерных систем в малигнизированную ткань [MotzerR.J. etal, 2006, deBouardS. et al, 2007, Zhou J. etal, 2012, Wicki A. etal, 2012].
Исследования ингибиторов VEGFR2, действие которых направлено на подавление пролиферации, миграции и выживаемости эндотелиоцитов, и приводящее к регрессии сосудистой сети, снижению плотности и диаметра сосудов, нарушению их проницаемости и замедлению роста опухоли, формируют новое научное направление патогенетической терапии опухолей Н. etal, 2009, Norden A.D. etal, 2009, Wang F. etal, 2011]. В настоящее время целый ряд ингибиторов VEGFR2 проходит клинические испытания, включая препарат на основе моноклональных антител к экстраклеточному фрагменту VEGFR2 (рамуцирумаб) [SpratlinJ. etal, 2011, Clarke J.M.etal, 2013].
Несмотря на многообещающие результаты преклинических исследований, эффективность антиангиогенных препаратов в клинике оказывается существенно ниже, особенно в случае терапии опухолей мозга. Малигнизированные клетки обладают высокой устойчивостью и способностью быстро адаптироваться, поэтому для повышения эффективности противоопухолевой терапии должны разрабатываться новые стратегии селективной терапии [ShojaeiF. etal, 2008, Bikfalvi A. etal, 2011, Liu W. etal, 2011].
В последнее время исследуются возможности применения VEGFR2 в качестве молекулярного вектора для направленной доставки контейнерных систем, загруженных терапевтическими или диагностическими препаратами. Известно, что неопластические сосуды имеют ряд структурных и функциональных особенностей: хаотичный характер ветвления, многочисленные петли, переплетения, слепые отростки, отсутствие структурированности, малое количество окружающих перицитов и высокую проницаемость сосудистой стенки [Nagy J.A. et al, 2002, Jain R. К. etal, 2005, Nagy J.A. et al, 2009]. Более того, в случае опухолей головного мозга имеет место выраженное нарушение структуры гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [Caraglia М. et al, 2012, Chacko A.M. et al, 2013]. Такие структурные особенности сосудистой сети можно использовать для избирательной доставки наноразмерных контейнеров в опухолевую ткань. Так, было продемонстрировано повышение эффективности терапии и доставки лекарственных препаратов с использованием липосомальных систем, загруженных доксорубицином и конъюгированных с aHTH-VEGFR2 антителами на мышиных моделях рака молочной железы и колоректального рака A. et al, 2012]. Тем не менее аспекты использования моноклональных антител к VEGFR2 для доставки наноконтейнеров в опухоли мозга и изучение селективности их распределения в малигнизированной ткани остаются неизученными.
Цель работы: Изучить эффекты моноклональных антител к рекомбинантному экстраклеточному фрагменту рецептора второго типа фактора роста эндотелия сосудов на миграцию клеток в монослойных культурах и перспективы их применения для разработки контейнерных систем направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в клетки-мишени глиом.
Задачи:
-
Получить штамм-продуцент, высокоэффективно продуцирующий рекомбинантный экстраклеточный фрагмент VEGFR2 рецептора.
-
Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к VEGFR2, провести иммунохимическую характеристику полученных антител.
-
Разработать метод количественного лиганд-рецепторного анализа VEGFR2.
-
Исследовать влияние моноклональных антител к VEGFR2 на миграцию клеток культуры глиомы Сб.
-
Оценить селективность накопления векторных наноконтейнерных систем на основе моноклональных aHTH-VEGFR2 антител в опухолевых клетках.
Научная новизна:
Выявлена способность моноклональных антител к VEGFR2 ингибировать миграцию глиомных клеток в тесте повреждения монослоя клеток глиомы С6 (wound healing test).
В ходе исследования показано свойство моноклональных aHTH-VEGFR2 антител повышать эффективность и специфичность накопления векторных наногелей на основе ПЭГ-б-ПМАК клетками культуры глиобластомы человека U87-MG и глиомы Сб.
На интракраниальной модели глиомы впервые продемонстрирован эффект захвата и накопления векторных наногелей, конъюгированных с моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами клетками глиомы С6 при системном введении.
Установлена способность полученного рекомбинантного экстраклеточного фрагмента взаимодействовать с лигандом в лиганд-рецепторном иммуноблот-анализе и разработана высокоселективная система лиганд-рецепторного анализа для количественного определения VEGFR2.
Практическая значимость:
Разработанный лиганд-рецепторный анализ на основе метода непрямого твердофазного иммуноферментного метода может быть рекомендован в качестве системы для количественного определения растворимых форм VEGFR2 рецептора в биологических жидкостях.
Разработанная векторная наноконтейнерная система на основе моноклональных антител, конъюгированных с наногелями, может применяться для повышения эффективности терапии и диагностики онкологических заболеваний в эксперименте.
Положения, выносимые на защиту
1. Иммунизация мышей рекомбинантным препаратом VEGFR2 позволяет получать гибридные клетки, продуцирующие высокоаффинные моноклональные aHTH-VEGFR2 ттт антитела.
-
Миграция глиомных клеток в тесте повреждения монослоя глиомы С6 (wound healing test) ингибируется моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами.
-
Клетки глиомы С6 способны захватывать и накапливать векторные наногели, конъюгированные с моноклональными aHTH-VEGFR2 антителами при системном введении.
Апробация диссертационной работы
Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на XXVIII (91-й) СЕССИИ ОБЩЕГО СОБРАНИЯ РАМН (4-5 июня 2013 г.); Межлабораторных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 2011-2013; Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2011 -2013.
Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры и отдела медицинских нанобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО «Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова» Минздрава Российской Федерации и сотрудников отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦ Социальной и Судебной Психиатрии имени В.П. Сербского» 12 июля 2013 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них пять - статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу, 1 схему и 28 рисунков. Список литературы включает 6 отечественных и 239 иностранных источников.
