Введение к работе
Актуальность проблемы. Процесс . окислительного фосфорилирования в тканях млекопитающих связан с функционированием нескольких полиферментных систем, локализованных во внутренней мембране митохондрий: а) ферментов дыхательной цепи, обеспечивающих окисление субстратов дыхания, последующий перенос электронов к молекулярному зшслороду и образование трансмембранний разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Ацн+); б) ИГ*"~АТР-синтазы (I^FQ-АТРазы),, катализирующей Дріц+ -зависимый синтез АТР из ADP и неорганического фосфата; в) системы, обеспечивающей транспорт метаболитов в митохондрии. Механизм А|іц+ -зависимого синтеза АТР в настоящее время не установлен. Большинство авторов, изучая гидролиз или синтез АТР, явно или неявно отовдествляют механизмы прямой и обратной реакции t Senior, 1988; Vignais & Satre,. 1984]. Однако целый ряд экспериментальных фактов, касающихся взаимодействия АТРазы с нуклеотидами и другими естественными лигвндами, указывает на то, что механизмы синтеза и гидролиза АТР могут различаться CPedersen, 1975; MJj&oy et al., 1980; Larson et al., 19891. В настоящее время известно, что АТР-синтаза способна связывать в общей сложности 6 молекул нуклеотидов, 1-2 молекулы неорганического фосфата и до 5 ионов двухвалентных металлов. В связи с этим возиогта существование большого числа различных фермент-лигавдшх . комплексов. Установление функциональных проявлений связывания лигандов -субстратов (продуктов) синтеза АТР - необходимо для выяснения
механизма окислительного ^сформирования. Эта задача и.
составляет предмет настоящего исследования.
Цель работы. Около десяти лет назад в группе А.Д.Виноградова было показано, что преинкубация субмнтохондриальных частиц с ADP в присутствии ионов М^+ приводит к гистэрезисному поведению фермента в АТРазной реакции CFltin et al., 1979]. Связывание ADP в специфическом центре Н*"-АТР-синтазы с Кдас~ 2-Ю М блокирует гидролиз АТР, однако не влияет на окислительное фосфорилированив CMinkov et al.. 1980]. Подробное изучение параметров (fcfgr+)ADP- зависимого тормокэния АТРазной активности привело к Бознккковению гипотезы о различии путей синтеза и гидролиза АТР„ катализируемых митохондриальнои Н*"-АТР-синтазой. Согласно этой гипотэзв, фермент может находиться в двух функционально различных состояниях: "синтетазном" и "гидролазном", а переход из одной формы в другу» контролируется нуклеотидами (ADP и ATP) tVasilyeva, et al.» 1980]. В раде работ были описаны условия, при которых .moesio проследить взаимодействие высокоаффинного центра связывания ADP и "каталитического центра" фермента' [Vasilyeva et al., 19801. Отдельные экспериментальные наблюдения указывали на то. что взаимодействие АТРазы с адениновыш нуклеотидами имеет весьма слоккув природу. В связи с этим, первой задачей настоящего исследования было изучение роли ADP и АТР в регулировании АТРазной активности.
Известно, что ингибирукщэе действие ADP проявляется только в присутствии ионов Йг+. Поэтому значительная часть настоящей работы посвящена исследовании роли ионов Mg2* в ADP-зевисимом ингибировании АТРазы.
з Таким образом, целью настоящей работа: было детальное
изучение роли нуклеотидов и ионов металлов в регулировании
активности митохондриальной іГ^-АТР-синтазн. .
Научная новизна работы. Получены экспериментальные данные, показывающие функциональное взаимодействие трех нуклеотидсвязывакщих центров митохондриальной АТРазы: двух центров связывания ADP (КдаС= 2-Ю"8 М и К^,= 7-Ю"6 М) и каталитического центра фермента. Обнаружен центр связывания 'ионов MS2"1" (K„jC= 2-Ю"6 М)„ быстрое рН зависимое насыщение которого приводит к медленной трансформации АТРазы, содержащей прочносвязанный АБР, из активной формы в неактивную. [Ы(Г+ )АВР-блокированная АГРаза медленно реактивируется в присутствии избытка ЭДТА (1^. = 0,007 мин ). Связывание с ферментом АТР (Н3= б'10 U) и неорганического фосфата (Кд= I-10~3 М) из растворов,, не содержащих двухвалентных катионов, существенно ускоряет процесс реактивации.
Практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные данные позволяют расширить представления о функциональном значении лиганд-связыванщих центров митохондриальной АТРазыо Результаты используются в лекциях по кинетике ферментативных рэакций для студентов - биохимиков. На основании работы предложено несколько демонстрационных задач для большого практикума по биоэнергетике на кафедре биохимии.
Апробация работы. Результаты исследования' были доложены на заседании кафедра биохимии Биологического факультета МГУ»' на Всесоюзной конференции "Энергетические аспекты клеточной физиологии1" (1988 її 1990 гг., Пущино), на V (1988 г., Эбериствит) и VI (1990 г., Амстердам) Европейских
ЗаЬБ-145/02ф
4 биоэнергетических конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов;, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 15~ стр. машинописного текста, включая Н табл. и $L рис. Библиография включает 26/ наименования, из них 2.S3 иностранных работ.
Митохондрии сердца бнка получали по методу Крейна и соввт. [Crane et al., 19561 с расслоением ни легкую и тяжелую фракции по методу Хатефи [Hatefl et al.", 1953].
Субмитохондриальнив частицы (СМЧ): А-СМЧ получали из тлжелих митохондрий обработкой ультразвуком IPessenden et al., 19661.
AS-СМЧ получали по методу Ракера, пропуская А-СМЧ через колонку с Сефадвксом G-53 (грубый) [Racker et al., 196Т1.
ASD-СМЧ получали из AS-СМЧ (10 мг/мл), преинкубируя их в среде, содержащей 0,25 Ы сахарозу, 10 мМ Нерея, рН 7,4, I мМ MgCl2 и 5 мкМ ADP. Затем в среду инкубации добавляли 3 мМ ЭДТА и пропускали частицы через колонку с Сбфадексом G-50 (грубки) в течение I ч при 200 в растворе, содержащем 75 ыМ сахарозу, 10 мМ Hepes, рН 7,4, 0,1 U KCL, 3 № ЭДТА. Элюат центрифугировали при 200000 g (17С) в течение 45 мин. Осадок суспендировали в
среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 20 мкМ ЭДТА,и переосаждали
при тех же режимах. Полученный препарат ASD-СМЧ суспендировали в 0,25 М сахарозе.
АТРпзную активность СМЧ измеряли спектрофотометрически при 340 нм (20С) в 1,5 мл стандартной среда, содержащей 0,25 М сахарозу, 10 мМ Нерез, рН 7,4, 0,1-1 мМ АТР, 2 мМ MgClg, 50 мкМ ЭДТА, 4 мкМ ротенон, 10 мкМ разобщитель (G1CCP), I мМ фосфоенолпируват, 0,16 мМ NADH, пируваткиназу (5,5 ед. акт./мл.) и лактатдегидрогеназу (5 ед. акт./мл.). Реакцию начинали внесением в среду 10-20 мкг белка частиц. Для точного измерения начальной скорости гидролиза АТР в ряде экспериментов в реакционную среду добавляли 0,1 мМ NaNg tVasilyeva et al., .1982].
Регистрацию АГРазной активности при помощи установки для быстрого смешивания проводили на спектрофотометре "Hitachi-557". Шприцы смесителя заполняли 5 'мл среды инкубации различного состава, содержащей субмитохондриальные частицы в концентрации 0,25 мг/мл, и 5 мл среда измерения АТРазяой активности, включающей следующие основные компоненты: 0,25 М сахарозу, 10 мМ Hepes, рН 7,4, 4 Ш MgClg, 0,1 мМ ЭДТА, 6 мкМ ротенон, 10 мкМ 01ССР, 4 мМ фосфоенолпируват, 0,6 Ш NADH, пируваткиназу (60 ед. акт./мл.), лактатдегидрогеназу (60-70 ед. акт./мл.) и АТР в таких количествах, чтобы после смешивания его конечная концентрация была равна 0,1 или I ММ. За ходом реакции следили спектрофотометрически при 340 нм по убыли концентрации NADH.
Концентрации белка в препаратах СМЧ определяли с Скуратовым реактивом tCornall et al.], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Концентрацию растворов MgClg определяли методом 'комп-
ЗаьБ-143/Э5ф
6.
лексонметрического титрования при щелочных рН в присутствен
металлохромного индикатора - Эриохрома черного Т.