Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из значительных проблем, стоящих перед живыми организмами, является необходимость адекватного ответа на изменение многочисленных факторов внешней среды. В случае прокариотических клеток, из-за ограниченности их генома, наиболее целесообразным решением данной проблемы явился бы путь рецепции каких-либо интегральных параметров. В качестве такого параметра может выступать, например, протондвижущая сила. Действительно, из-за того, что Дрн* продуцируется на сопрягающей мембране за счет большого количества различных процессов, ее величина будет зависеть от концентрации всевозможных дыхательных субстратов, акцепторов элкторокрБ для дыхательной цепи, присутствия различных ингибиторов электронного транспорта, а так же и от интенсивности сгета (для фототрофных микроорганизмов). В таком случае рецепция единственного ф.іктора - ДДн+ - должна позволять бактериям ориентироваться в большом многообразии изменяющихся параметров среды обитания. Действительно, для Halobacteriuin salinarium было продемонстрировано наличие Арц' -зависимой системы таксиса (Bibikov et al., 1991,1993). С другой стороны, если микроорганизм лишен возможности избежать неблагоприятных условий посредством таксиса, рецепция уровня протондвижущей силы могла бы давать сигнал также и для переключения метаболизма бактерии на альтернативные пути. К примеру, д/ія поддержания высокой внутриклеточной концентрации АТФ в условиях пониженно» Дрн* достаточно было бы активизировать путь гликолиза и, соответственно, связанных с ним процессов субстратного фосфорилирования. Способ этот, однако, недейственней в случае роста бактерий на несбраживаемых субстратах, таких, как, например, сукцинат. Альтернативным механизмом для поддержания уровня АТФ может служить переключение энергетики микроорганизма с протонного на натриевый цикл (Skulachev, 1984,1989).
За последние годы в нашей группе была показана возможность фмжнионнропанпя псиротошюго (натриевого) цикла у E.coii и Bacillus FTU i,\\elisyan ct al., 1991). Индукция наїриіі-транслоцируїошеіі дыхательной цепи у данных чикроорганшчон происходила именно при понижении Дрц+ на сопрягающей мембране (пырашипанпс в присутствии разобщителей, цианида, а так же при высоких значениях рН) (Аветисян и др., 1990; Semeykina&Skukichev, 1992). Также нами были
получены указания, что одним из генераторов Дрм/ в дыхательной цени Е.со яштяется терминальная оксидаза Ы-типа (Aveiisyan ct al., 1992). В связи с ли интересным казался вопрос о том, что является сигналом для индукции лої фермента (то есть замены хинолоксидазы Zw-типа (протонной помпы) і хинолоксидазу bd-тнпа (предположительно натриевую помну)). В группе Липа и 199 году была выдвинута гипотеза о влиянии окислительно-восстановительного состоят -компонентов-дыхагельной-цепи-на^ретупяцию экспрессии цитохрома d (luchi el al 1990a). В нашей группе, однако, были получены экспериментальные результаті опровергающие данную гипотезу (Bogachev et al., 19936). Мы предположили, чт сигналом для индукции терминальной оксидазы foZ-типа у E.coli является понижені уровня протондвижущей силы. Таким образом, основной целью настоящей работ явилось укснение во?можности функционирования Дрн* в качестве фактор регулирующего степень экспрессии цитохрома d.
В настоящее вре.чя известно, что уровень экспрессии терминальных оксидаз Ы и fcd-типа у E.coli регулируется arc- и /«/--системами (luchi et al., 1990; Spiro&Gue! 1991). Поэтому было бы также важным изучить, какая нз этих регуляторпых систс ответственнд за индукцию хинолоксидазы bd-типа при понижении ДДц* і сопрягающей мембране данного микроорганизма.
Целью настоящей работы было: 1) установить природу сигнал регулирующего уровень экспрессии терминальной оксидазы bd-тяпа у E.coli; определить вклад arc- и/nr- регуляторпых систем в индукцию хинолоксидазы bd-тш при понижении уровня протондвижущей силы; 3) изучить регуляцию зкепрессі основных ферментов E.coli, синтез которых опосредован влиянием я/г-системы, и| изменении различных факторов внешней среды.
Научная новизна работы. В ходе исследований впервые пзмерсі индуцирующие цитохром d и Дрцт-диссипирующие активности различш разобщителей на интактных клетках E.coli. Полученые данные подтверждают гипотс о роли понижения уровня ДРн* в индукции синтеза терминальной оксидазы bd-іш Установленно также, что «rc-система (в отличие от /nr-системы), вовлечена в проце повышения уровня экспрессии цитохрома d под действием разобщителей. Анал регуляции экспрессии цитохрома d и сукцинатдегидрогеназы при изменен различных факторов внешней среды позволяет выдвинуть предположение
существовании у E.coli какой-то дополнительной регуляторной системы (отличной от arc-, fnr- и аррУ-систем). Эта система, по-видимому, участвует в регуляции экспрессии сукцинатдещпрогеназы; сигналом для ее активации служит повышение уровня постановленное какого-то компонента дыхательной цепи.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты облегчают понимание процесса адаптации энергетического метаболизма E.coli как при переходе из аэробных условий роста в анаэробные, так и при росте клеток в условиях, сопровождающихся понижением протовдгшжущей силы на цптоплазматической мембране данного микроорганизма. Данные, указывающие на существование у E.coli какой-то дополнительной, на настоящий момент неизвестной регуляторной системы, моїут служить стимулом для поиска и идентификации этого регуляторного компонента.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на российско-германском симпозиуме молодых ученых (Оспабрюк, Германия, 1994) и на Международной конференции "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995). Работа также была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включающей разделы "Материалы и методы", "Результаты" и "Обсуждение"), выводов и списка цитируемой литературы.