Введение к работе
Актуальность проблемы. Рост галофильных и галотолерантных микроорганизмов при повышенных концентрациях NaCl в среде сопровождается накоплением в клетках органических осмопротекторов в концентрациях, уравновешивающих внешнее осмотическое давление. Из (гипер)соленых и щелочных водоемов выделены галофильные и галотолерантные аэробные метилотрофы (Khmelenina et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; Doronina et al., 2003), использующие в качестве источников углерода и энергии метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии). Установлено, что облигатный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и метилобактерии Methylophaga thalassica и Methylophaga alcalica при росте на среде с повышенной концентрацией NaCl синтезируют циклическую иминокислоту - эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат) в качестве основного осмопротектора (Khmelenina et al., 1999; Doronina et al., 2003). Детальное изучение регуляции биосинтеза эктоина галофильными бактериями обусловлено практическими задачами получения эктоина - полифункционального биопротектора, перспективного для использования в медицине и косметике, а также в научной практике в качестве водоудерживающего средства и стабилизатора биомолекул и целых клеток (Graf et al., 2008).
Биосинтез эктоина у галофильных бактерий начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося Ь-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией Л'-ацетил-Ь-2,4-ДАБ в эктоин (Galinski, 1995). Эти реакции катализируются специфическими ферментами - ДАБ-ацетилтрансферазой (EctA), ДАБ-аминотрансферазой (EctB) и эктоинсинтазой (EctC). Недавно было показано, что у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica, М. thalassica последовательность реакций биосинтеза эктоина идентична таковой у галофильных гетеротрофов, а гены, кодирующие ферменты биосинтеза эктоина, сцеплены в ectABCask оперон, с дополнительным геном аспартаткиназы (ask) (Решетников и др., 2006).
Поскольку накопление осмолитов бактериями - процесс, зависимый от внешней солености, логично полагать, что существует специфическая регуляция биосинтеза эктоина на биохимическом и генетическом уровнях. Однако, несмотря на интенсивные исследования физиологии и биохимии продуцентов эктоина, ферменты, катализирующие реакции биосинтеза эктоина, частично охарактеризованы только у гетеротрофной бактерии Halomonas elongata (Ono et al., 1999), а сведения о факторах, влияющих на уровень транскрипции соответствующих генов, отсутствуют. В связи с вышеизложенным представлялось актуальным исследовать метаболические и генетические аспекты регуляции биосинтеза эктоина у метанотрофов и метилобактерии - свойства ферментов биосинтеза эктоина (на примере EctA) для
выявления эффекторов, влияющих на их активность, а также регуляцию транскрипции оперона ectABCasky гало(алкало)фильныхметилотрофных бактерий.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучение регуляции биосинтеза эктоина аэробными гало(алкало)фильными метано- и метилотрофными бактериями на уровне активности ферментов биосинтеза эктоина и транскрипции ectABCask оперона.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Выделить и охарактеризовать рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы (EctA) из метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z и метилобактерий М. alcalica и М. thalassica.
Определить нуклеотидные последовательности генов ectR, кодирующих предполагаемые транскрипционные регуляторы ectABCask оперонов у Mm. alcaliphilum 20Z, М. alcalica и М. thalassica.
Определить промоторные области ectABCask оперонов и генов ectR у Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica.
Выделить и охарактеризовать предполагаемые транскрипционные белки-регуляторы EctR из Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica.
Научная новизна. Получены и охарактеризованы рекомбинантные ДАБ-ацетилтрансферазы. Показано, что свойства ДАБ-ацетилтрансферазы коррелируют с экофизиологическими особенностями изучаемых бактерий.
Впервые установлено, что регуляция биосинтеза эктоина у изучаемых метилотрофных бактерий происходит на уровне транскрипции ectABCask оперона. Определено, что оперон ectABCask у Mm. alcaliphilum 20Z и М. thalassica транскрибируется с двух промоторов (Р1 и Р2).
Выше ес/-оперона обнаружены гены (ectR), кодирующие белки, гомологичные белкам-регуляторам семейства MarR. Получены и охарактеризованы гомогенные препараты белков EctR, показана их способность обратимо связываться с Р1 промоторной областью ес/-оперона в пределах предполагаемой -10 последовательности. Уровень экспрессии с промотора Р1 регулируется белком EctR и увеличивается в условиях высокой осмолярности среды, тогда как с промотора Р2 осуществляется низкая конститутивная экспрессия генов биосинтеза эктоина, не регулируемая продуктом гена ectR.
Найдено, что у Mm. alcaliphilum 20Z, в отличие от М. thalassica, транскрипция гена ectR осуществляется с единственного промотора PR, расположенного между промоторами Р1 и Р2 есї-оперона. Предполагается, что транскрипция гена ectR у Mm. alcaliphilum 20Z контролируется собственным продуктом, т.е. EctR является ауторегу лятором.
Практическое значение работы. Данная работа расширяет наши представления о регуляции биосинтеза эктоина и создает предпосылки для эффективной реализации биотехнологического потенциала гало(алкало)фильных метанотрофов и метилобактерий, как возможных продуцентов биопротектора эктоина.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2003-2007гг), на 8-, 9- и 10-ой международных школах-конференциях молодых ученых (Пушино, 2004-2006 гг.), на Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2005 и 2007), на международной научной конференции "Современные проблемы микробиологии и биотехнологии" (Одесса, 2007), на международной научной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 2008), на школе-конференции "Биология: традиции и инновации в 21 веке" (Казань, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, глава в книге "Adaptation to Life at High Salt Concentration in Archae, Bacteria and Еикагуа"и 7 тезисов.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов в рамках плана научно-исследовательских работ УРАН ИБФМ РАН по теме «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.2.00708221).
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам УРАН ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению и написанию данной диссертационной работы: д.б.н. Дорониной Н.В., к.х.н. Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Захаровой М.В., ст.лаб. Вотевой Г.В., а также сотрудникам УРАН ИБ РАН к.б.н. Ксензеко В.Н. и Глухову А.С. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям - д.б.н., проф. Троценко Ю.А., д.б.н. Хмелениной В.Н. и к.б.н. Решетникову А.С.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 96 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 199 ссылок, содержит 4 таблицы и 29 рисунков.
