Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Немелкоклеточный рак легкого. Разнообразие форм данного вида опухолей 12
1.2 Генетические мутации как наиболее частые причины развития легочной аденокарциномы 13
1.3 Трансгенные мыши как модель исследования опухолей легкого 15
1.4 Роль стволовых клеток в развитии рака легкого 17
1.5 Эпителиально-мезенхимальный переход и его роль в метастазировании опухолей 17
1.6 TGF-/SMAD – один из основных сигнальных путей, активирующих процесс эпителиально-мезенхимального перехода 19
1.7 Плотные межклеточные контакты, их строение и роль 21
в эпителиально-мезенхимальном переходе 21
1.8 Эволюционно консервативные белки Мусаши – потенциальные регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода 23
1.9 Основные мишени белков Мусаши, регулирующие рост и метастазировании опухолей 26
1.10 Заключение 28
Экспериментальная часть 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1 Реактивы и оборудование 30
2.2 Объекты исследования
2.2.1 Объекты исследования in vitro 34
2.2.2 Объекты исследования in vivo 36
2.3 Анализ экспрессии Msi2 в образцах ткани легкого с помощью метода тканевых матриц 37
2.4 Подготовка и иммуногистохимическое окрашивание образцов опухолей и метастазов мышей
2.5 Количественный анализ препаратов, полученных in vivo 39
2.6 Анализ уровня экспрессии генов методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 40
2.7 Количественный анализ уровней белков с помощью метода протеиновых тест-систем обратной фазы (RPPA) 40
2.8 Трансфекция клеток малой интерферирующей РНК 41
2.9 Получение клонов нокдаунов Msi2 с помощью коротких шпилечных РНК и лентивирусов 41
2.10 Анализ жизнеспособности клеток in vitro 42
2.11 Анализ инвазивной способности клеток in vitro 43
2.12 Оценка роста клеток с помощью 43
метода выращивания трехмерных клеточных сфер 43
2.13 Анализ уровня экспрессии белков методом Вестерн блоттинга 44
2.14 Исследование клеток с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии 45
2.15 Эксперименты со сверхэкспрессией генов 46
2.16 Исследование клеточного цикла с помощью проточной цитометрии 47
2.17 Статистическая обработка данных 48
ГЛАВА 3. Результаты исследования 49
3.1 Исследование экспрессии гена Msi2 в легочной аденокарциноме с высокой метастатической способностью 49
3.2 Исследование влияния экспрессии Msi2 на инвазивную способность клеток легочной аденокарциномы с высоким метастатическим потенциалом in vitro 52
3.3 Опухоли с пониженной экспрессией Msi2 демонстрируют меньшую метастатическую активность in vivo 55
3.4 Определение основных белков-мишеней Msi2 в опухолях легкого 57
3.5 Исследование влияния Msi2 на трансляцию белков-мишеней, регулирующих инвазию 61
3.6 Влияние уровня Msi2 на изменение межклеточных контактов и фенотип смешанного эпителиально-мезенхимального перехода 63
3.7 Msi2 регулирует инвазию, влияя на сигнальный путь TGF- и экспрессию клаудинов 67
3.8 Msi2 оказывает влияние на механизмы репарации ДНК и является потенциальным маркером эффективности химиотерапии рака легкого 71
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 75
Выводы 80
Список литературы
- Эпителиально-мезенхимальный переход и его роль в метастазировании опухолей
- Анализ экспрессии Msi2 в образцах ткани легкого с помощью метода тканевых матриц
- Получение клонов нокдаунов Msi2 с помощью коротких шпилечных РНК и лентивирусов
- Опухоли с пониженной экспрессией Msi2 демонстрируют меньшую метастатическую активность in vivo
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в большинстве развитых стран мира рак легкого занимает лидирующее место по распространенности у мужчин и второе у женщин (Siegel et al., 2013). Пятилетняя выживаемость при заболевании немелкоклеточным раком легкого составляет около 16% (Howlader et al., 2013). Ведущей причиной такой высокой смертности являются распространенные метастазы, наличие которых приводит к изменению биологических свойств опухолевых клеток и сопровождается все возрастающей резистентностью к применяемым традиционным методам лечения.
Наиболее частыми причинами возникновения немелкоклеточного рака легкого у человека являются активирующая мутация K-Ras (около 30%) (Mitsudomi et al., 1991), а также потеря аллеля p53 (около 60% случаев) (Takahashi et al., 1989). Опухоли в легких трансгенных К-Ras/р53 нокаутных мышей имеют свойства аденокарциномы человека (Zheng et al., 2007), благодаря чему эта модель является удобным инструментом, позволяющим изучить биологические процессы, лежащие в основе развития и метастазирования аденокарциномы, в частности – эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) опухолевых клеток.
Процесс ЭМП играет определяющую роль в развитии метастатического
процесса (Hay et al., 1995; Kalluri, Weinberg et al., 2009). Чаще всего это
происходит за счет изменения нормального функционирования
внутриклеточных белковых сигнальных путей, например, фактора роста опухолей бета (TGF-), а также за счет смены фенотипа опухолевых клеток с эпителиального на мезенхимальный, а затем обратно на эпителиальный (Zavadil et al., 2005; Taylor et al., 2010).
Вышеперечисленные могут регулироваться определенными
внутриклеточными белками, гены которых в норме экспрессируются на этапах эмбрионального развития, а затем в стволовых клетках. Одними из таких белков
являются эволюционно консервативные белки Мусаши (Msi1 и Msi2). Они кодируются генами Msi1 и Msi2 и имеют большой процент гомологии, в частности, в РНК связующих последовательностях. Мусаши описаны в литературе как регуляторы трансляции мРНК большого количества белков-мишеней, оказывающие таким образом влияние на множество биологических процессов, включая деление стволовых клеток (Sakakibara et al., 2001; Siddal et al., 2006) и клеточный цикл (Park et al., 2014). Msi2 изучен в меньшей степени, чем его гомолог Msi1, и его роль хорошо показана в контексте лейкозов (Park et al., 2014; Ito et al., 2010; Kharas et al., 2011), а также некоторых солидных опухолей. Во всех случаях повышенный уровень Msi2 ассоциировался с ухудшением клинического прогноза, развитием метастазов и более злокачественным течением заболевания.
Цель настоящей работы заключалась в определении механизма,
посредством которого белок Msi2, уровень которого повышен в опухолях,
может оказывать влияние на рост и метастазирование легочной
аденокарциномы.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.
-
Провести скрининг и измерить уровни экспрессии генов стволовых клеток в мышиных клеточных линиях рака легкого для определения тех маркеров, уровень которых повышен в клетках с высоким метастатическим потенциалом.
-
Измерить уровень белка Msi2 в образцах опухолевой и нормальной ткани пациентов с немелкоклеточным раком легкого.
-
Исследовать биологическую роль белка Msi2 на примере мышиной модели рака легкого.
-
Определить сигнальные пути и белки-мишени, воздействуя на которые белок Msi2 проявляет свой биологический эффект.
Научная новизна. В работе был впервые описан механизм регуляции
метастазирования легочной аденокарциномы белком Msi2. Показано, что у
пациентов с немелкоклеточным раком легкого повышен уровень этого
трансляционного регулятора. Это приводит к нарушению онкогенных
сигнальных путей и усилению метастазирования легочной аденокарциномы.
Был определен механизм этого усиления - установлены белки-мишени Msi2:
клаудины -3, -5, -7, TGF-R1 и SMAD3. Показано, что путем патологической
активации сигнального пути TGF-/SMAD и уменьшения количества плотных
контактов в клетках Msi2 усиливает метастазирование легочной
аденокарциномы, тем самым способствуя ее злокачественному
распространению.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты
способствуют более детальному пониманию внутриклеточных процессов,
лежащих в основе метастазирования рака легкого, приводящих к
возникновению резистентности к лечению, которой зачастую сопровождается
появление метастазов этого вида опухолей. При этом открываются новые
возможности улучшения современных методов диагностики, прогнозирования
течения и терапии данного заболевания в профильных научно-
исследовательских центрах, таких как Российский онкологический научный
центр им. Н.Н. Блохина, Московский научно-исследовательский
онкологический институт им. П.А. Герцена, а также онкологических стационарах.
Описанные механизмы белок-белковых взаимодействий являются важными для понимания связей между сигнальными путями в клетке. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения, в качестве создания новых стратегий терапии, так и с точки зрения фундаментальных дисциплин: молекулярной биологии и биохимии.
Положения, выносимые на защиту:
-
Уровень маркера стволовых клеток Msi2 повышен в мышиных клетках рака легкого с высоким метастатическим потенциалом и образцах опухолевой ткани пациентов с легочной аденокарциномой.
-
Уменьшение экспрессии гена Msi2 вследствие его выключения in vitro уменьшает инвазивную способность клеток легочной аденокарциномы с высоким метастатическим потенциалом in vitro и метастазирование in vivo.
-
Msi2 способен регулировать инвазию опухолевых клеток опосредованно путем активации сигнального пути TGF-/SMAD.
-
Msi2 способен усиливать процесс эпителиально-мезенхимального перехода опухолевых клеток за счет снижения количества плотных межклеточных контактов и уменьшения уровня клаудинов.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на
четырех международных научно-практических конференциях: на двух
ежегодных конференциях Американской ассоциации исследования опухоли
(Филадельфия, 2015 и Новый Орлеан, 2016, США), на ежегодной
конференции Американского Общества клинической онкологии (Чикаго,
2015, США) и на ежегодной конференции Американского общества изучения
биологии клетки (Филадельфия, США, 2014). Также результаты
докладывались на 19-ой, 20-ой и 21-й ежегодных конференциях онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2014, 2015, 2016); на VIII Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в 21 веке» (Казань, 2015, Россия).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, среди которых 2 публикации в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК и 8 публикаций в журналах базы SCOPUS.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 149 наименований.
Эпителиально-мезенхимальный переход и его роль в метастазировании опухолей
Эти мутации встречаются в подавляющем большинстве случаев АК легкого (рис. 1) и определяют чувствительность опухолей к химиотерапии (Коган и соавт., 2003; Ding et al., 2008; Imielinski et al., 2012; Heist et al., 2012).
Большинство из них (кроме тех, которые являются мутациями генов сигнального пути киназы PI3K) в доклинических исследованиях описаны как ведущие – определяющие возникновение опухоли (Weiss et al., 2010; Guagnano et al., 2012; Hammerman et al., 2011).
Определение роли с оматических мутаций в раке легкого стало возможным благодаря развитию новых технологий. Например, анализ данных библиотек, составленных путем использования скринингов с помощью малых шпилечных РНК, позволил определить гены, способствующие опухолевой трансформации клеток, такие как K-Ras-активирующие мутации и инактивация р53. Благодаря этому стало возможным использование потенциально новых терапевтических мишеней, таких как TANK-связывающая киназа (TBK1) (Barbie et al., 2009). Аналогично, использование масс-спектрометрии при изучении метаболических, белковых и фосфокиназных сигнальных путей позволило открыть такие явления, как ROS1 слияние генов, а также потенциально новый диагностический и прогностический маркер изоцитрат дегидрогеназу 1 (Sun et al., 2013; Tan et al., 2012).
За счет последних достижений и новых подходов к исследованию, быстрыми темпами растет понимание биологических процессов, лежащих в основе развития немелкоклеточного рака легкого, а также его метастазирования.
Использование моделей трансгенных мышей (ТГМ) упростило исследование немелкоклеточного рака легкого, так как не всегда представляется возможным получить для изучения достаточное количество образцов ткани пациентов или получить клеточные линии из нее. Это ос обенно важно при проведении доклинических испытаний препаратов, изучении процессов метастазирования, трансплантации опухолевых клеток (Xu et al., 2014; Curtis et al., 2010; Chen et al., 2012; Ji et al., 2006). На сегодняшний день используются ТГМ модели основных ведущих мутаций в немелкоклеточном раке, таких, как K-Ras, EGFR и АLK, и, несмотря на то, что в генетическом плане они не столь разнообразны, как человеческие опухоли, они все же обладают в достаточной степени сходством, как на микроскопическом уровне, так и при ответе на различные виды терапии (Chen et al., 2012).
ТГМ-модели очень информативны при изучении эффектов мутации определенных генов, последствий изменения экспрессии различных генов in vivo. Например, мышиная модель с конститутивным K-RasG12D нокаутом позволяет исследовать все этапы развития опухоли, начиная с самых ранних и заканчивая процессами ее метастазирования (Jackson et al., 2005). Ее с легкостью можно использовать для сопутствующего получения двойных и более нокаутов. Опухоли у K-RasG12D нокаутных мышей развиваются очень медленно, и, зачастую, останавливаются в развитии на этапе аденом, однако при комбинировании нокаута K-RasG12D с p53 этот процесс значительно ускоряется, и опухоли прогрессируют до состояния аденокарциномы и начинают метастазировать гораздо быстрее (Jackson et al., 2005; Oliver et al., 2010).
Изучая процесс возникновения опухолей в ТГМ - моделях, стало возможным также охарактеризовать механизмы, лежащие в основе онкогенной трансформации клеток человека (Kwon et al., 2013). Первичные изменения наблюдались тогда, когда в результате повреждения (воспаления, воздействия аденовируса, таких веществ, как нафталин) происходила делеция р53 в ТГМ (Kim et al., 2005; Desai et al., 2014; Mainardi et al., 2014; Rowbotham et al., 2014). Клеточные линии, полученные из K-Ras/p53 нокаутной мышиной модели, благодаря удобству и ее сходству как на геномном, так и на клеточном уровне с человеческой аденокарциномой, были активно использованы в данном исследовании.
Для опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого характерна повышенная экспрессия маркеров стволовых клеток (Arasada et al., 2014; Singh et al., 2012). Согласно существующей гипотезе, стволовые клетки в дифференцированных тканях становятся опухолевыми потому, что только они живут достаточно долго для того, чтобы накопить определенный набор мутаций, повреждений генов, необходимых для роста опухоли (Visvader et al., 2011). Кроме этого , стволовые клетки имеют большую способность к самовоспроизведению и не нуждаются в активном э пигенетическом перепрограммировании. Однако, даже дифференцированные клетки с ограниченной способностью самовоспроизведения за счет приобретения свойств стволовых клеток в ответ на повреждения генов, изменение условий окружающей их ткани и повышение экспрессии маркеров стволовых клеток, могут становиться опухолевыми и носить злокачественный характер, в дальнейшем метастазируя (Tata et al., 2013; Chaffer et al., 2011).
Успех метастазирования опухолевых клеток напрямую зависит от инвазии клеток в межклеточный матрикс, попадания в системный крово- и лимфоток, диссеминации и закрепления во вторичных очагах роста. Важную роль в обретении опухолевыми клетками способности диссеминировать играет процесс эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Во время ЭМП закрепленные эпителиальные клетки меняют свои свойства, теряя межклеточные контакты, полярность, и приобретают свойства мезенхимальных клеток, в частности – подвижность и способность к инвазии (Hay et al., 1995).
На биохимическом уровне клетки перестают экспрессировать эпителиальные маркеры, такие, как белок межклеточных контактов Е-кадгерин и катенины, и начинают экспрессировать мезенхимальные маркеры, такие, как виментин и фибронектин.
В исследованиях, проведенных на моделях о пухолевых ксенотрансплантатов и клеточных культур , показано, что ЭМП способствует отделению клеток друг от друга и метастазированию в дистальные органы (рис. 2) (Hay et al., 1995; Kalluri, Weinberg et al., 2009; Thiery et al., 2009).
Анализ экспрессии Msi2 в образцах ткани легкого с помощью метода тканевых матриц
Все эксперименты, в которых были использованы мыши, проводились в соответствии со стандартными протоколами, одобренными Комитетом по содержанию и обращению с животными в лабораторных целях (IACUC -Institutional Animal Care and Use Committee) в Онкологическом центре «Фокс Чейз» (Филадельфия, США).
Мыши содержались в стерильных условиях, свободных от патогенов. Эксперименты с ортотопическими ксенотрансплантатами были проведены с использованием иммунокомпетентных генетически идентичных (сингенных) мышей дикого типа линии 129Sv. Возраст мышей составлял около 6 недель.
Внутрилегочная инъекция представляла собой суспензию из 1 млн клеток в стандартной питательной среде (смотреть выше) объемом 100 мкл в соответствии с опубликованной ранее методикой (Onn et al., 2003). Состояние мышей регулярно отслеживалось, после чего они были усыплены с помощью СО2 на 28 день. После вскрытия визуально было определено количество метастазов в противоположном легком, в лимфатических узлах средостения, грудной клетке и удаленных экстраторакальных участках и взяты ткани легкого для дальнейшей иммуногистохимической обработки.
При проведении экспериментов с подкожными трансплантантами, C.B17 мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) в возрасте 8 недель с использованием иглы калибра 27g были подкожно подсажены н а левый и правый бока со стороны спины клетки 344SQ и H157 в виде суспензии 10 млн клеток объемом 100 мкл. Клетки клеточной линии 344SQ были трансфецированы малой шпилечной РНК к Msi2.
Мыши были пальпированы дважды в неделю для оценки динамики роста. Объем опухол ей определялся путем наружного измерения штангенциркулем. Были определены наибольший продольный диаметр (длина) и наибольший поперечный диаметр (ширина) в каждом случае. Объем опухоли рассчитывался по м одифицированной формуле для эл липса на основе описанных измерений: Объем=1/2(длинаХширина). Вес мышей измерялся дважды в неделю. Через три недели после подсаживания клеток мыши были усыплены с помощью СО2, опухоли и легкие были взяты для последующего анализа.
Для оценки изменения уровня сигнальных белков мыши с подкожными опухолями клеточной линии H157 были лечены физиологическим раствором, а также препаратами иринотекан (SN38) в дозах 100 и 60мг/кг массы тела и STA-12-8666 в дозах 100, 60 и 33мг/кг.
Образцы ткани немелкоклеточного рака легкого, полученные в ходе хирурических резекций с 1997 по 2012 годы и находящиеся в репозитории биоматериала Онкологического центра «Фокс Чейз» (Fox Chase Cancer Center (FCCC) Biosample Repository Facility), были использованы для создания тканевых микро-матриц (TMAissue microarrays). При этом ткань из одной опухоли помещалась на два уникальных участка на TMA.
Все образцы опухолевой ткани были получены из первичных опухолей и/или метастазов в лимфоузлах. Участки нормального легкого были полуены от здоровых пациентов. Клиническая информация доступна в базе данных Библиотеки Биологических Образцов в сжатом виде из клинических баз данных с анонимной личной информацией пациентов. Пациенты дали свое согласие на забор и анонимное хранение образцов опухоли, взятых у них. Данные TMA были получены при помощи микроскопа HistoRx PM-2000 (HistoRx) и обработаны на программном обеспечении AQUAsition.
Монохромные цифровые изображения окрашивания цитокератина были визуализированы при помощи линзы AF555. Затем в автоматическом режиме на полученных изображениях на области с опухолевой тканью накладывалась сетка в тех случаях, когда опухолевая ткань составляла минимум 5% всей области. Области ядер определялись по окрашиванию с помощью DAPI. Индекс AQUA рассчитывался в зависимости от интенсивности целевого сигнала в области наложенной сетки. Полученные значения нормализовались на значения экспозиции и глубины цвета автоматически.
Получение клонов нокдаунов Msi2 с помощью коротких шпилечных РНК и лентивирусов
В результате сверхэкспрессии с применением лентивирусного вектора было обнаружено отсутствие эффекта в способности клеток к росту . Однако, что примечательно, инвазия в Матригеле была сильно повышена у клеток со сверхэкспрессированным Msi2 (рис 15).
Таким образом, учитывая вышеизложенные результаты, было принято решение о дальнейшем механистическом анализе внутриклеточных сигнальных путей, лежащих в основе повышенной инвазивной способности клеток.
Для подтверждения результатов, полученных in vitro, был проведен ряд экспериментов in vivo с использованием мышиных моделей. В первом эксперименте, была произведена инъекция клонов мышиной клеточной линии 344SQ (с нокдауном Msi2 и контроль) ортотопически в легкие иммунокомпетентных 129Sv мышей. Общее количество метастазов в противоположном легком было значительно меньше у мышей, которым были введены клетки со сниженным уровнем Msi2, при том, что размер индивидуальных метастатических узлов не отличался, по сравнению с
Результаты анализа метастазирования и роста клеточной линии 344SQ in vivo после ортотопического введения 344SQ клеточной линии с нокдауном Msi2 в легкие 129Sv мышей. На графиках: количество (А) и площадь (Б) метастазов в противоположное легкое, уровни КІ67 (В) и каспазы 3 (Г) в метастазах. Данные нормализованы относительно SCR-контроля. , р 0.05 контролем (рис 16 А, Б).
Результаты введения 344SQ клеточной линии с нокдауном Msi2 подкожно мышам С.В17 SCID. Слева - данные количественного анализа. Справа -репрезентативные иллюстрации. (А) Площать метастазов. (Б) - уровень КІ67 и (В) -каспазы 3. Данные нормализованы относительно SCR контроля. Линейка - 2мм. , р 0.0001 препараты легкого, и оценены уровни экспрессии маркера пролиферации Ki-67 и апоптоза – каспазы 3 (рис 16 В, Г).
Как видно из графиков, статистически значимой разницы в экспрессии этих маркеров нет между группами. Далее, в другом эксперименте, те же клоны 344SQ клеточной линии были подсажены подкожно С.В17 мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Как следует из рисунка 17,наблюдается статистически значимое различие в количестве легочных метастазов между группами с преобладанием их в группе контроля (рис 17 А).
По окончании эксперимента и после иммуногистохимического окрашивания препаратов легких на Ki67 и каспазу 3 были получены данные, сходные с предыдущим экспериментом – отсутствовала статистически значимая разница в экспрессии этих маркеров между группами (рис 17 Б, В).
Полученные результаты говорят о том, что повышенная экспрессия Msi2 характерна для метастазирующих опухолей аденокарциномы легкого, при этом важна роль Msi2 в поддержании высокой способности к метастазированию и инвазии опухолевых клеток, in vitro и in vivo, без влияния на способность клеток к росту.
С помощью метода белковых тест-систем обратной фазы (reverse-phase protein array, RPPA) (Iadevaia et al., 2010; Tibes et al., 2006) мы оценили влияние нокдауна Msi2 на экспрессию 171 белка (фосфорилированных форм и общего количества) в мышиной клеточной линии 344SQ с целью выявления новых релевантных мишеней Msi2, вовлеченных в сигнальные пути, контролирующие инвазию и эпителиально-мезенхимальный переход (рис 18). Рис 18. Тепловая карта данных RPPA анализа. См. описание в тексте. , р 0.05
Таким образом, были идентифицированы белки, уровень которых изменился наиболее значительно (относительно остальных) в результате нокдауна Msi2.
Среди них: клаудин 7 – белок, ассоциированный с плотными межклеточными контактами (Lu et al., 2011; Bruna et al., 2012; Prat et al., 2013), концентрация которого была повышена в 19,4 раз, а также фибронектин-1 (FN1) (Liu et al., 2008; Urtreger et al., 2006; Zhang et al., 2009; Yi and Rouslahti et al., 2001), уровень которого увеличился в 2,5 раза.
Изменения экспрессии генов соответствующих белков на уровне трансляции и транскрипции были в дальнейшем проверены с использованием Вестерн блоттинга и количественной ОТ-ПЦР, соответственно. Результаты указанных экспериментов согласовались с данными RPPA.
Так, нокдаун гена Msi2 во всех четырех клеточных линиях привел к значительному повышению уровня мРНК фибронектина-1 (в 4 – 9,4 раза) и белка (в 2,4 – 23 раза), в зависимости от клеточной линии , а также белка клаудина-7 (в 2,5 – 28 раз) в трех из четырех клеточных линий (рис 19 А, Б). Эти
Опухоли с пониженной экспрессией Msi2 демонстрируют меньшую метастатическую активность in vivo
Несмотря на то, что в некоторых исследованиях отмечена онкогенная роль Msi1, гомолога Msi2, последний описан в гораздо меньшей степени (Surebanet al., 2008; Lietal., 2011; Oskarsson et al., 2011). Высокие уровни Msi1 были показаны в глиомах, раке толстого кишечника, в клетках эндометриальной карциномы (Sureban et al., 2008; de Sousa Abreu et al., 2009). Онкогенная роль Msi2 была показана в мышиной модели рака толстого кишечника: экспрессия Msi2 была индуцирована потерей гена APC (наиболее частая причина возникновения р ака толстого кишечника), и сверхэкспрессия Msi2 вызывала фенотипическую картину опухолевого роста, характерную для д елеции АРС (Wang et al., 2015).
Также Msi2 является онкогеном с повышенной экспрессиией при лейкозах. Увеличение уровня Msi2 обычно сочетается с плохим прогнозом при заболевании лейкемией и развитием кризиса бластных клеток, и в некоторых исследованиях нокдаун Msi2 или его делеция вызывали уменьшение способности опухолевых клеток приживаться и снижали их жизнеспособность за счет уменьшения пролиферации (Park et al., 2014; Ito et al., 2010; Kharas et al., 2011).
Механизм, лежащий в основе наблюдаемых эффектов, был обусловлен снижением чувствительности к TGF- за счет нарушения сигнального пути TGF- и SMAD3.
Ранее транскриптомные анализы показали, что , будучи трансляционными регуляторами, белки Мусаши контролируют экспрессию значительного количества мРНК белков (Kwon et al. 2015), в том числе и TGF-.
Сигнальный путь TGF- в литературе описан как основной индуктор эпителиально-мезенхимального перехода при прогрессировании опухолей (Zavadil et al., 2005; Taylor et al., 2010), за счет чего опухолевые клетки эпителиального происхождения приобретают свойства, характерные для мезенхимальных – способности к инвазии и метастазированию. Результаты нашего исследования подтверждают TGF- - и SMAD3 -опосредованную биологическую роль Msi2 в немелкоклеточном раке легкого . Кроме того, нами впервые было показано, что TGF-R1 регулирует экспрессию Е-кадгерина, а также способность к инвазии опосредованно через белок Msi2. Также, нами было показано, что уровень экспрессии Msi2 повышается по мере того, как опухоли становятся более способными к метастазированию в мышиных моделях легочной аденокарциномы, а также в образцах опухолевой ткани пациентов.
Учитывая вышесказанное, можно говорить о том, что экспрессия Msi2 коррелирует с изменением сигнального пути TGF- от про-пролиферативного к про-метастатическому, по мере развития опухоли (Massague et al., 2012). Для полного понимания функциональной роли Msi2 в развитии немелкоклеточного рака легкого необходимо проведение дополнительных исследований, таких, как анализ клинических корреляций.
Важно отметить, что в нашем исследовании было выявлено важное отличие регуляторной роли Msi2 в немелкоклеточном раке легкого, от таковой при лейкозах. В последних Msi2 в большей степени регулирует пролиферацию, а не инвазию опухолевых клеток. Кроме того , в одном исследовании, посвященном опухолям молочной железы, была показана роль белков Мусаши в поддержании люминального фенотипа эпителиальных клеток железы (Katz et al., 2014). Результаты нашего исследования указывают на более комплексную роль Msi2, так как было показано увеличение уровней белков E-кадгерина, виментина, SLUG и SNAIL, а также супрессия Zeb-1/2, FoxC2 и клаудинов.
Ранее было показано, что в раке легкого TGF- способен поддерживать эспрессию SNAIL, но не Zeb-1/2 (Liu et al., 2013), из чего можно сделать предположение, что воздействие на столь далекие в сигнальном пути Msi2 мишени является как TGF--опосредованным, так и независимым от него. Представленные нами данные регуляции внутриклеточного сигнального пути TGF- белком Msi2, а также то , что он способен влиять на уровень экспрессии Е-кадгерина в клетках, совпадают с приведенной в литературе моделью регуляции в опухолях молочной железы (Shamir et al., 2015). Однако в контексте рака легкого этот механизм описан нами впервые.
Не описанная ранее в опухолях легкого фенотипическая картина эпителиально-мезенхимального перехода, вызванного понижением уровня экспрессии кла удинов, была охарактеризована в литературе в случаях резизтентного к химиотерапии рака молочной железы и мочевого пузыря (Creighton et al., 2009; Hennessy et al., 2009; Choi et al., 2014). Известно, что повышение уровня клаудина-7 способно уменьшить метастатическую способность рака легкого (Lu et al., 2008), а низкий уровень его экспрессии сочетается с плохим прогнозом (Yamamoto et al., 2010).
Транскрипцинный фактор SNAIL, активность которого увеличивается при эпителиально-мезенхимальном переходе во время активации сигнального пути TGF-/SMAD, напрямую связывается с промоторами генов клаудинов-3, -4, -7, вызывая их супрессию, а следовательно уменьшая общий уровень этих белков (Vincent et al., 2009). Данный механизм снижения экспрессии клаудинов был описан при развитии опухолей молочной железы.
Нами впервые показано, что Msi2 опосредованно понижает экспрессию множества клаудинов, и, в частности, клаудина-7, таким образом, поддерживая высокую способность опухолевых клеток к метастазированию и отражая таким образом картину смешанного мезенхимально-эпителиального перехода.