Содержание к диссертации
стр.
ВВЩЕНЙЕ 5
ГЛАВІ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Влияние холестерина на микровязкость мембраны 8
Влияние холестерина на активность мембранных ферментов 15
Возрастные изменения биологических мембран. 20
Старение эукариотических и прокариотических клеток в культуре 24
1.5. Биохимия и старение- клеток микопдазмы 29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИЙ 36
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССВДОВАНИЙ
3.1. Изменение липидного состава мембран в про
цессе роста Культуры A.laidlawii 55
Определение фаз роста культуры 55
Исследование состава мембранных ли-пидов в процессе роста культуры .... 57
3.2. Изменение МИКРОВЯЗКОСТИ Мембран A.laidla-
wii в процессе роста культуры ... 62
Изменение активности мембраносвязанных ферментов и глюкозосвязывающего белка с возрастом культуры 68
Выделение и очистка АТФазы и глюкозосвязы-вающего белка из мембран^.laidiawii и их
характеристика 74
3.4.1. Получение препаратов Fj -фактора и
комплекса АТФазы 74
3.4.2. Структурные и каталитические свой
ства *i и VFI АТ&ззы 78
3.4.3. Выделение глюкозосвязывающего белка 83
3.5. Влияние холестерина на физико-химические
свойства протеолипосом 84
ГЛАВА 4. ОБСУЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 93
ВЫВОДЫ . 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
_ 4 -
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ — аденозинтрифосфат ЩФ - аденозиндифосфат ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ДЭАЭ - целлюлоза-диэтиламиноэтилцеллюлоза ТХУ - трихлоруксусная кислота
НДЦН - восстановленный никотинамидадениндинуклеотид ТЭШД - WjN^N'jN1- тетраметилендиамин р± - неорганический фосфат ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДІЩ - n,n»> дициклогексилкарбодиимид 5- NS - 5-доксилстеариновая кислота 6-Ю - 6-10-доксилпальмитиновая кислота СМ2 - спинмеченое производное карболина ^470^%92 " соотношение интенсивяостей флуоресценции эксимеров
и мономеров пирена V - максимальная скорость ферментативной реакции к - константа Михаэлиса
Н+-АТФаза - протонтранслоцирующая аденозинтрифосфатаза Fj -фактор - гидрофильная часть АТФазы, растворимая АТФаза F0 -фактор - гидрофобная часть АТФазы ЯМР - ядерный магнитный резонанс ЭПР - электронный парамагнитный резонанс
Введение к работе
Изучение биологических аспектов старения представляет собой проблему, разрешение которой невозможно без привлечения методов различных естественных наук. В плане ее решения в последние годы предпринимаются попытки связать старение многоклеточного организма со структурно-функциональными перестройками клеток органов и тканей и, прежде всего, их мембран, как одного из наиболее важных компонентов клетки (Zs.-Nagy, 1978; Hegner, 1980.), Согласно этим представлениям увеличение жесткости клеточных мембран с возрастом приводит к нарушению гомеостаза клетки, что свидетельствует о клеточном старении. Основой так называемой мембранной гипотезы старения является понятие жидкокристаллического состояния., биологической мембраны, как необходимого условия ее оптимального функционирования. Предполагается, что снижение мембранной текучести, выражающееся в уменьшении молекулярной подвижности составляющих ее белков и липидов, является существенным фактором процесса старения (Лопухин и др., I983J.
Экспериментальные данные, накопленные за последние годы в области мембранологии, свидетельствуют о ключевой роли липидной фазы мембран в метаболических реакциях, катализируемых мембранными ферментами, в процессах транспорта, рецепции, иммуногенеза. В этом плане значительный интерес представляет выяснение роли холестерина, как одного из основных компонентов липидного бислоя плазматической мембраны, в регуляции мембранной текучести. Возрастное накопление холестерина в клетках органов и тканей животных и человека рассматривается авторами мембранной гипотезы в качестве одной из основных причин увеличения микровязкости клеточных мембран с возрастом. Изучению влияния холестерина на функци-
онирование биомембраны, а также факторов, контролирующих его включение в мембрану, уделяется в настоящее время большое внимание и в связи с проблемой атеросклероза, в механизме которого существенным звеном является накопление холестерина в плазматической мембране артериальных клеток.
Данные литературы о возрастных изменениях клеточных мембран немногочисленны и довольно противоречивы; число экспериментальных исследований их липидного состава также ограничено. Объектом, обладающим определенными преимуществами для исследования структуры и функций плазматической мембраны в возрастном аспекте, являются клетки микоплазмы при развитии культуры в пределах одного пассака. Эти прокариотические организмы лишены клеточной стенки и обладают только одним типом мембран - плазматическим. Подобно животным клеткам микоплазмы включают холестерин в состав плазматической мембраны, благодаря чему становится возможным использование их в качестве модели для изучения механизма включения этого стероида в биомембраны, а также влияния его на структуру и функции мембраны.
В связи с вышесказанным целью настоящей работы явилось выявление возрастных изменений физического состояния плазматической мембраиы и активности мембранных ферментов клеток Achoie-piasma laidiawii, а также исследование роли холестерина в механизме этих изменений. В процессе выполнения работы были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Изучить зависимость липидного состава мембран клеток А,
laidiawii от возраста культуры.
2. Исследовать возрастные изменения микровязкости мембраны
и активности мембран освязанных ферментов: АТФазы и ШН-дегидро-
геназы, а также глюкозосвязывающего белка в клетках культуры А.
- 7 -laidlawii. Выявить взаимосвязь изменения этих показателей с изменением липидного состава мембран.
Разработать методы выделения и очистки АТФазы и глюкозо-связывающего белка из мембран этих клеток и охарактеризовать полученные препараты,
Исследовать влияние холестерина на микровязкость мембраны протеолипосом и активность встроенных в них белков микоплазмы: АТФазы и глюкозосвязывающего белка.
Решение поставленных задач позволило выявить закономерности возрастных изменений мембран прокариотических клеток и сравнить их с таковыми клеток эукариотов, в результате чего данное исследование явилось экспериментальной проверкой мембранной гипотезы старения.
