Содержание к диссертации
Введение
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 5
1.1. Х-актинин и его роль в двигательных системах 6
1.2. Физические и химические свойства актинина 16
1.3. Выделение и физико-химические свойства о-актинина из немышечных тканей 24
1.3.1. Выделение ос-актинина из тромбоцитов ткани 25
1.3.2. Взаимодействия оС-актинина с Ф-актином 28
1.4. Изучение некоторых свойств об-актинина 29
П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34
П.І. Материалы 35
П.2. Методы исследования 35
Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 43
Ш.І. Выделение и характеристика od-актинина из спинных мышц кролика 44
Ш.2. Классификация остатков цистеина <*-актинина 48
Ш.З. SH-грушш и биологическая активность od-актинина 63
Ш.4. Ограниченный трипсинолиз актинина и распределение сульфгидрильных групп по фрагментам молекулы 75
ВЫВОДЫ 90
ЛИТЕРАТУРА 92
- Х-актинин и его роль в двигательных системах
- Материалы
- Выделение и характеристика od-актинина из спинных мышц кролика
Х-актинин и его роль в двигательных системах
В 1964 году Эбаши и сотрудники /56,57/ из обычно получаемых препаратов актина выделили минорный белок, вызывающий значительное возрастание скорости и степени суперпреципитации синтетического актомиозина. Этот белок был назван б-актинином. Эбаши и сотрудники /57,58,106/ описали также ряд свойств ос-акти-нина. Обычно получаемые препараты актина содержат всегда большее или меньшее количество « .-актинина. Взаимодействие между миозином и препаратом актина, освобожденного от примесей об-актинина, очень слабое при обычных концентрациях АТР, т.е. суперпреципитация при таких условиях трудно наблюдаема. Добавление ос-актини-на резко усиливает взаимодействие между актином и миозином, в результате чего скорость суперпреципитации сильно повышается. Добавление od-актинина к Г-актину повышает скорость его полимеризации и при этом значительные количества ос-актинина соосаж-даются с Ф-актином.
Однако, дальнейшие исследования показали, что -актинин, полученный Эбаши с сотр. не является гомогенным. В частности, Голл с сотр. /72/ показали, что препарат Эбаши содержит только от 5 до 20 % 6S компонента, соответствующего максимально гомогенному ot-актинину. Попытки фракционирования этого препарата повторным высаливанием сульфатом аммония или 3,3 М ксі не повышает содержания 6 s компонента в исходном препарате. Применение ионо-обменной и гель-проникающей хроматографии также не принесло успеха, поэтому Робсон с сотр. /19,118/ предложили полностью изменить метод выделения белка, исходя из экстракта миофибрилл раствором с низкой ионной силой. Метод основан на двух наблюдениях: во-первых, было показано Штромером с сотр. /142/, что z-диски могут быть удалены из глиценизированных спинных мышц кролика длительным экстрагированием раствором с низкой ионной силой. Голл с сотр. /72,73/ и Масаки с сотр. /108/ показали, что о -актинин входит в состав z-диска и поэтому такая экстракция мышечных волокон должна приводить к солюбилизации ос -акти-нина. Во-вторых, Перри и Кореи /113/ показали, что при экстракции миофибрилл раствором с низкой ионной силой отделяются белки, отличающиеся от миозина. Однако эта работа была сделана еще до открытия ос -актинина. Пересмотр этих ранних работ позволил сделать заключение, что в экстракте о низкой ионной силой может содержаться ос-актинин.
В методе Робсона полученный экстракт фракционируется далее сульфатом аммония и найдено, что наиболее активной фракцией является 6 S компонент ос -актинина, которая высаливается в диапазоне концентраций сульфата аммония 15-25 % (фракция 15-25 Р).
Предложенный метод выделения белка отличается более мягкими условиями (температура 2 С) и дает более высокое содержание 6 s активной фракции, что является очень существенным для дальнейших стадий очистки.
На основе разработанного метода авторы сделали попытку оценить количество OL -актинина в мышцах и его соотношение с Ф -актином. Выход фракции 15-25 Р составлял 107 мг белка из 100 г разрушенных мышц. Эта фракция содержала около 25 % 6 s белка, т.е. 32,1 мг 6 s белка на 100 г мышц, или 0,32 мг ее -актинина на I г мышц. Принимая во внимание потери при экстракции и дальнейшей очистке ( 50 %), в мышцах должно содержаться около 0,8 мг ос-актинина на грамм мышц. Если из общего миофибрил-лярного белка 20 % приходится на актин, то вычисляемое соотношение ос -актинин/Ф -актин в мышце должно составлять 1/25 по
Материалы
В работе использованы N- [2,3-1] -малеимид (Amersham, Англия) 5,5 -дитиобис-(2-нитро)-бензойная кислота (Serva, ФРГ), трипсин (worthington , США), еефадекс G-25 (Pharmacia, Швеция) набор реактивов для диск-электрофореза в полиакриламидном геле ( Bio-Rad, США), додецилсульфат натрия, целлюлоза ДЕ-32 (Pharmacia , Швеция), рентгеновская пленка X-Omat (Kodak, США). Все остальные реактивы имели ішалификациго "осч".
Выделение и характеристика od-актинина из спинных мышц кролика
В настоящее время описано несколько методов выделения и очистки о( -актинина из различных тканей. Все эти методы достаточно сложны и многостадийны. За основу нами был выбран метод, описанный Робсоном с сотр. (1970). После некоторой модификации он включает следующие основные стадии: I) экстракция белка из мышечного фарша, из которого предварительно были удалены миозин и белки М-полосы; 2) фракционирование полученного экстракта сульфатом аммония, при этом ос -актинин осаждается в пределах насыщения сульфатом аммония 15-25 %; 3) хроматография на ДЕ-целлюлозе. Общий путь выделения ос-актинина представлен на схеме I, а характеристика каждой стадии очистки на рис.1.
Степень чистоты выделенного а -актинина, оцененная по данным электрофореза в полиакриламидном геле (ПМГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДОН) и определения N-концевых аминокислот, составляет около 100 %. Молекулярная масса, определенная с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН, равна около 100 килодальтон (КД). Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными.
