Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Общие представления о миграции и инвазии клеток 12
1.1.1. Миграция клеток 12
1.1.2. Инвазия клеток 16
1.2.Общая характеристика цитозольного белка теплового шока 90 (Hsp90)
1.2.1. Общая характеристика и классификация белков теплового шока 19
1.2.2. Общая характеристика Hsp90 19
1.2.3. Структурная организация Hsp90 и конформационый цикл 20
1.2.4. Шаперонный комплекс Hsp90 и его функционирование 23
1.2.5. Физиологическая роль внутриклеточного Hsp90 24
1.3. Экстраклеточный белок теплового шока 90 (Hsp90) 26
1.3.1. Секреция и мембранная экспрессия Hsp90 27
1.3.2. Роль экстраклеточного Hsp90 в ранозаживлении 30
1.3.3. Роль экстраклеточного Hsp90 в развитии опухолевого процесса 32
1.3.4. Механизмы действия экстраклеточного Hsp90 34
1.4. Поверхностные клеточные гепарансульфат протеогликаны 37
1.4.1. Общая характеристика и структура гепарансульфат протеогликанов 37
1.4.2. Функционирование и биологическая роль клеточных ГСПГ 40
1.5. Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Химические реактивы, среды и материалы 44
2.2. Животные 45
2.3. Очистка белков теплового шока Hsp90 и Hsp70 45
2.3.1. Очистка суммарного Hsp90 из ткани мозга животных 45
2.3.1.1. Приготовление тиофильного геля 45
2.3.1.2. Приготовление гомогената ткани 45
2.3.1.3. Фракционирование с помощью сульфата аммония 45
2.3.1.4. Хроматография Hsp90 на тиофильном геле 46
2.3.1.5. Ионообменная хроматография Hsp90
2.3.2. Иммуноаффинная очистка двух изоформ Hsp90 46
2.3.3. Флюорохромирование нативного Hsp90 47
2.3.4. Очистка белка теплового шока 70 47
2.4. Получение Hsp90-специфических поликлональных антител 47
2.4.1. Синтез пептидов и получение конъюгатов пептидов с белками 47
2.4.2. Получение Hsp90-специфических иммуноаффинных носителей 44
2.4.2.1. Конъюгирование нативного Hsp90 с нерастворимыми носителями
2.4.2.2. Конъюгирование Hsp90-специфических пептидов с нерастворимыми
носителями 48
2.4.3. Иммунизация кроликов и анализ гипериммунных сывороток 48
2.4.4. Иммуноаффинная очистка Hsp90-специфических антител
2.4.4.1. Предварительное фракционирование кроличьих антисывороток 49
2.4.4.2. Иммуноаффинная очистка Hsp90-специфических антител 49
2.4.5. Очистка контрольных поликлональных антител из сывороток неиммунизированных кроликов 49
2.5. Определение концентрации белков 50
2.6. Электрофорез белков 50
2.7. Вестерн-блот анализ 50
2.8. Иммуноферментные методы
2.8.1. Непрямой ИФА 51
2.8.2. Конкурентный ИФА 51
2.9. Связывание Hsp90 с гепарин-сефарозой 52
2.10. Культивирование клеток 52
2.11. Определение токсичности и антипролиферативной активности препаратов 52
2.11.1. Подготовка образцов очищенных белков и Hsp90-специфических антител для анализа на клеточных культурах 53
2.11.2. Определение прямой цитотоксичности препаратов 53
2.11.3. Оценка антипролиферативной активности препаратов 53
2.12. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток 53
2.12.1. Иммунофлуоресцентное окрашивание внутриклеточных белков 54
2.12.2. Иммунофлуоресцентное окрашивание мембранных белков
2.12.2.1. Метод конфокальной микроскопии 54
2.12.2.2. Метод проточной цитофлуориметрии 54
2.12.3. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание мембранных белков 55
2.13. Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на мембранную экспрессию Hsp90 56
2.13.1. Обработка клеток хлоратом натрия 56
2.13.2. Обработка клеток смесью гепариназ I/III 56
2.13.3. Обработка клеток сульфированными гликозаминогликанами 57
2.13.3.1. Определение чувствительности мембрана-ассоциированных Hsp90 к 57
сульфированным гликозаминогликанам
2.13.3.2. Восстановление мембранной экспрессии Hsp90 после обработки 57
клеток гепарином
2.13.4. Обработка клеток ингибиторами синтеза и секреции белков 58
2.14. Определение миграции клеток in vitro 58
2.14.1. Определение неиндуцированной миграции клеток путем измерения скорости зарастания экспериментальной раны 58
2.14.2. Определение неиндуцированной миграции клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 59
2.14.3. Оценка Hsp90-индуцированной миграции клеток путем измерения скорости зарастания экспериментальной раны 60
2.14.4. Оценка Hsp90-индуцированной миграции клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 60
2.15. Определение инвазии клеток in vitro 61
2.15.1. Определение неиндуцированной инвазии клеток 61
2.15.2. Определение Hsp90-индуцированной инвазии клеток с помощью вкладышей с полупроницаемой мембраной 61
2.16. Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на миграцию и инвазию клеток 61
2.16.1. Обработка клеток хлоратом натрия 62
2.16.2. Обработка клеток смесью гепариназ I/III 62
2.16.3. Влияние сульфированных гликозаминогликанов, сополимера 2,5-ДГБК-желатин, ингибитора MK-2206 на миграцию и инвазию клеток
2.17. Определение уровня фосфорилирования Akt 63
2.18. Статистический анализ данных 63
ГЛАВА 3. Результаты исследований 64
3.1. Получение и характеристика очищенного нативного Hsp90 и отдельных изоформ Hsp90 и Hsp90 64
3.1.1. Получение и характеристика очищенного нативного суммарного Hsp90 64
3.1.1.1. Разработка метода очистки препарата суммарного Hsp90 с использованием тиофильного геля 64
3.1.1.2. Очистка и физико-химическая характеристика суммарного Hsp90 66
3.1.2. Очистка и физико-химическая характеристика двух изоформ Hsp90 67
3.2. Получение и характеристика Hsp90-специфических поликлональных антител 70
3.2.1 Получение пептидных конъюгатов для иммунизации животных 70
3.2.2 Получение Hsp90-специфических антител 70
3.3. Экспрессия двух изоформ Hsp90 и рецепторов Hsp90 на плазматической клеточной мембране 74
3.3.1. Экспрессия Hsp90 и Hsp90 на плазматической мембране 74
3.3.2. Экспрессия LRP1 и HER2 на плазматической мембране 76
3.4. Роль двух изоформ мембрана-ассоциированного и свободного Hsp90 в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro 78
3.4.1. Исследование роли двух изоформ мембрана-ассоциированного Hsp90 в миграции и инвазии клеток in vitro 79
3.4.2. Исследование роли двух изоформ свободного Hsp90 в миграции и инвазии клеток in vitro 81
3.5. Участие клеточных гепарансульфат протеогликанов в связывании двух изоформ Hsp90 на поверхности клеточной мембраны 84
3.5.1. Связывание Hsp90 с иммобилизованным гепарином 84
3.5.2. Изучение роли поверхностных клеточных гепарансульфат протеогликанов в заякоривании двух изоформ Hsp90 плазматической клеточной мембране 85
3.5.3. Восстановление мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 после обработки клеток хлоратом натрия, смесью гепариназ I/III и гепарином 92
3.5.4. Изучение роли поверхностных клеточных ГСПГ в связывании свободного Hsp90 на плазматической мембране 95
3.5.5. Специфичность связывания Hsp90 и Hsp90 с поверхностными клеточными ГСПГ 97
3.6. Роль клеточных гепарансульфат протеогликанов в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro 98
3.6.1. Участие клеточных ГСПГ в неиндуцированной миграции и инвазии клеток 98
3.6.2. Участие клеточных ГСПГ в Hsp90-индуцированной миграции и инвазии клеток 100
3.6.3. Исследование роли поверхностных клеточных ГСПГ в трансдукции сигнала от Hsp90 внутрь клетки 102
3.7. Изучение транслокации двух изоформ мембрана-ассоциированного Hsp90
на плазматическую мембрану 105
3.8. Экспрессия на плазматической мембране двух изоформ Hsp90 в клетках, находящихся в различных физиологических состояниях 108
3.8.1. Экспрессия двух изоформ Hsp90 в клетках на границе повреждения клеточного монослоя 109
3.8.2. Уровень мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 в клетках, находящихся на разных фазах клеточного роста 110
3.8.3. Уровень мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 в клетках в бессывороточной среде, при активации клеток ЭБС или нативным Hsp90 111
3.8.4. Латеральное перераспределение двух изоформ Hsp90 на плазматической клеточной мембране между гепарин-чувствительными и гепарин-устойчивыми комплексами 114
Заключение 117
Выводы 125
Список основных публикаций по теме диссертации
- Шаперонный комплекс Hsp90 и его функционирование
- Флюорохромирование нативного Hsp90
- Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на мембранную экспрессию Hsp90
- Роль клеточных гепарансульфат протеогликанов в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы
Белок теплового шока 90 кДа (Hsp90) является одним из наиболее активно экспрессирующихся шаперонов в клетке, который присутствует в цитозоле как при нормальных, так и при стрессовых условиях (Csermely et al., 1998). Существует две изоформы внутриклеточного Hsp90 - Hsp90 (индуцибельная форма) и Hsp90 (конститутивная форма). Уровень гомологии изоформ составляет 86%, однако, имеются существенные различия в их биохимических свойствах, экспрессии и функционировании (Sreedhar et al., 2004). Выявлено более 200 внутриклеточных белков-клиентов Hsp90, разнообразных по структуре и функциям. Многообразие клиентских белков Hsp90 и их роль в ключевых клеточных процессах (трансдукция сигнала, внутриклеточная сигнализация, транскрипция, регуляция экспрессии генов и др.) определяют Hsp90 как одного из важнейших белков, участвующих в процессах пролиферации и дифференцировки клеток, клеточной подвижности, морфогенезе, развитии организмов, и других фундаментальных биологических процессах (Buchner, 1999; Picard, 2002).
В последнее время стало появляться все больше данных, свидетельствующих, что обе изоформы Hsp90 присутствуют во внеклеточном пространстве (свободный Hsp90) и на плазматической клеточной мембране (мембрана-ассоциированный Hsp90) (Cid et al., 2009; Eustace et al., 2004; Sidera et al., 2004). Оказалось, что экстраклеточный Hsp90 участвует в формировании врожденного и приобретенного иммунитета, способен выступать в качестве «сигналов опасности» в организме (Basu and Srivastava, 2000; Srivastava, 2002). Кроме этого, в последнее время накопились данные о важной роли экстраклеточного Hsp90 в обеспечении подвижности и инвазии нормальных и опухолевых клеток (Li et al., 2007, 2012; Sidera et al., 2008). Механизмы действия экстраклеточного Hsp90 на процессы миграции и инвазии клеток разнообразны. Экстраклеточный Hsp90 может выступать в качестве лиганда участвуя в рецептор-зависимой стимуляции процессов миграции и инвазии нормальных и опухолевых клеток (Chen et al., 2009; Hance et al., 2012; Jayaprakash et al., 2015; Tsen et al., 2013). Экстраклеточный Hsp90 способен функционировать как шаперон, связываясь с экстраклеточными мембрана-ассоциированными рецепторами, растворенными белками клеточного микроокружения (например, матриксными металлопротеиназами (ММР)) и белками внеклеточного матрикса (ВКМ), тем самым регулируя их активность (Eustace et al., 2004; Sidera et al., 2004, 2008). В этой части, экстраклеточный Hsp90 участвует в процессах ремоделирования ВКМ, влияя на инвазивную активность клеток (Mirastschijski et al., 2004; Vaughan et al., 2000). Кроме этого, Hsp90 регулирует экспрессию белков, участвующих в процессах миграции и инвазии клеток, например ММР и интегринов (Song et al., 2010; Stellas et al., 2010), а также индуцирует образование миофибробластоподобных опухолеассоциированных фибробластов (Shaw and Martin, 2009).
В настоящее время многие аспекты функционирования экстраклеточного Hsp90 неизвестны. До конца не выяснена роль отдельных изоформ мембрана-ассоциированного и свободного Hsp90 в миграции и инвазии клеток. В ряде работ показано, что секретированный Hsp90 стимулирует миграцию кератиноцитов, дермальных фибробластов и эндотелиальных клеток кожи (Cheng et al., 2008; Li et al., 2007, 2012), а также ряда опухолевых линий (Eustace et al., 2004), в то время как Hsp90|3 не участвует в этих процессах. С другой стороны, установлено, что обе изоформы мембрана-ассоциированного Hsp90 участвуют в миграции и инвазии нейрональных клеток (Sidera et al., 2004, 2008; Yfanti et al.,
2004). До сих пор не исследованы многие аспекты экспрессии Hsp90 на плазматической клеточной мембране. У Hsp90 отсутствует сигнальный пептид и трансмембранный домен, которые обеспечивали бы его секрецию по классическому пути и/или мембранную экспрессию et al., 2012; Sreedhar et al., 2004). Известно, что Hsp90 секретируется с использованием экзосомального пути секреции белков (Clayton et al., 2005; 2004; McCready et al., 2010), однако механизмы транслокации Hsp90 на клеточную плазматическую мембрану и механизмы их ассоциации с плазматической мембраной не изучены. Данные по мембранной экспрессии Hsp90a и Hsp90p весьма противоречивы. Различные клетки экспрессируют на плазматической мембране либо обе изоформы Hsp90 (Sidera et al., 2004, 2008; Stellas et al., 2007, 2010), либо только Hsp90 (Cheng et al., 2008; Li et al., 2007; Song and Luo, 2010) или только Hsp90p (Hunter et al., 2014; Suzuki and Kulkarni, 2010). Стрессовые воздействия (температурный шок, гипоксия, окислительный стресс и т.д.) et al., 2016; Liao et al., 2000; Ramteke et al., 2013), а также отдельные ростовые факторы (Gopal et al., 2011; Song et al., 2010; Wang et al., 2009), приводят к повышению уровня мембранной экспрессии Hsp90, однако мембранная экспрессия отдельных изоформ Hsp90 в клетках, находящихся в различных физиологических состояниях, до сих пор не исследована.
Известно, что поверхностные клеточные гепарансульфат протеогликаны (ГСПГ) связывают многие факторы роста на поверхности клетки, тем самым модулируя их активность (Feyzi et al., 1997; Gallagher et al., 1998; Neufeld et al., 1999). Ранее было показано, что Hsp90 связывается с гепарин-сефарозой and 1993). Т.к. гепарин является структурным аналогом гепарансульфатов ГСПГ, это натолкнуло нас на мысль о том, что поверхностные клеточные ГСПГ могут участвовать в связывании Hsp90 на плазматической мембране и, тем самым, играть важную роль в миграции и инвазии клеток.
Цель и задачи работы
Целью работы было изучение роли двух изоформ экстраклеточного Hsp90 и гепарансульфат протеогликанов плазматической мембраны в миграции и инвазии опухолевых клеток человека in vitro.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить роль двух изоформ мембрана-ассоциированного и свободного
экстраклеточного Hsp90, Hsp90 и Hsp90, в процессах миграции и инвазии опухолевых
клеток in vitro.
-
Определить роль поверхностных клеточных ГСПГ в связывании двух изоформ мембрана-ассоциированного и свободного экстраклеточного Hsp90 на плазматической мембране клеток.
-
Изучить роль поверхностных клеточных ГСПГ в нестимулированной и Hsp90-стимулированной миграции и инвазии опухолевых клеток человека in vitro.
-
Исследовать механизмы транслокации двух изоформ Hsp90 на плазматическую мембрану клеток.
-
Изучить мембранную экспрессию двух изоформ Hsp90 в клетках, находящихся в различных физиологических состояниях.
Научная новизна работы
-
Впервые показано стимулирующее действие свободного экстраклеточного Hsp90 на миграцию и инвазию опухолевых клеток in vitro.
-
Впервые показано, что ГСПГ плазматической клеточной мембраны участвуют в связывании двух изоформ мембрана-ассоциированного и свободного Hsp90 на поверхности опухолевых клеток.
-
Впервые установлено, что поверхностные клеточные ГСПГ участвуют в Hsp90-стимулированной миграции и инвазии клеток in vitro.
-
Впервые доказано, что поверхностные клеточные ГСПГ играют важную роль в проведении сигнала от экстраклеточного Hsp90 внутрь клеток, с последующей активацией сигнальных путей, ответственных за клеточную подвижность.
5. Впервые обнаружено существование гепарин-чувствительных и гепарин-
устойчивых комплексов Hsp90 и Hsp90 на плазматической мембране клеток.
6. Впервые установлено, что в активно пролиферирующих и стимулированных
клетках значительно повышена экспрессия двух изоформ мембрана-ассоциированного
Hsp90, а также количество гепарин-устойчивых комплексов Hsp90 и Hsp90 на
плазматической клеточной мембране.
-
Впервые доказано, что ГСПГ плазматической клеточной мембраны могут функционировать в качестве экстраклеточного депо Hsp90, из которого Hsp90 и Hsp90 способны рекрутироваться в гепарин-устойчивые комплексы при стимуляции клеток. Поверхностные клеточные ГСПГ также способны выступать в качестве молекулярной ловушки, захватывая Hsp90 и Hsp90 после их диссоциации из гепарин-устойчивых комплексов.
-
Впервые показано, что экзосомальный путь секреции белков участвует в транслокации двух изоформHsp90 на плазматическую клеточную мембрану.
Практическая значимость работы
1. Данные, касающиеся важной роли двух изоформ мембрана-ассоциированного и
свободного экстраклеточного Hsp90 в стимуляции миграции и инвазии опухолевых клеток,
указывают на то, что как мембрана-ассоциированные, так и свободные экстраклеточные
Hsp90 и Hsp90, могут рассматриваться в качестве перспективных молекулярных мишеней
для разработки противоопухолевых препаратов антиметастатического действия.
2. Установленная важная роль поверхностных клеточных ГСПГ в связывании
экстраклеточного Hsp90 и обеспечении миграции и инвазии опухолевых клеток,
закладывают основу для разработки препаратов, обладающих гепарин-подобной
активностью и способных ингибировать метастазирование клеток in vivo.
Структура диссертации
Шаперонный комплекс Hsp90 и его функционирование
Механизм разборки адгезивныхконтактов на заднем крае клетки включает в себя их разрушение с последующим эндоцитозом отдельных компонентов адгезионных контактов (Ezratty E.J.et al., 2005). Важнейшим регулятором разборки контактов на задней части клетки является кальций, который, вероятно, регулирует активность кальпаина и кальцийневрина. Rho киназа и PAK также принимают участие в регуляции этого процесса (Vicente-Manzanares M. et al., 2005).
Взаимодействие клеток с субстратом и клеток между собой осуществляют молекулы адгезии. Большинство молекул адгезии принадлежит к шести семействам белков: интегрины, кадхерины, белки адгезии суперсемейства иммуноглобулинов, селектины и CD44 (Bozzuto G. et al., 2010). Клетки могут экспрессировать наборы различных молекул адгезии. Интегрины и CD44 принимают участие, в основном, во взаимодействии клеток с ВКМ, в то время как кадхерины, белки адгезии суперсемейства иммуноглобулинов, и селектины играют важную роль в межклеточных взаимодействиях.
Особую роль в клеточной миграции играют интегрины, участвуя во взаимодействиях с ВКМ и формировании адгезионных контактов (Hynes R.O., 2002).Интегрины относятся к семейству трансмембранных гликопротеинов-рецепторов, -субъединица и -субъединица интегринов пронизывают клеточную мембрану и включают в себя цитоплазматические домены, необходимые для трансдукции сигналов. В клетках интегрины участвуют в формировании фокальных (адгезионных) контактов (Zamir E. and Geiger B., 2001). Интегрины связываются с различными белками ВКМ, включая ламинин, фибронектин, тромбоспондин, коллагены и др. (Hogg N. and Landis R.C., 1993). После контакта с белками ВКМ, интегрины кластеризуются, рекрутируя через внутриклеточный домен либо адаптерные белки (например, альфа-актинин, тензин, таллин), либо белки сигнальных путей (например, FAK), что приводит к последовательным процессам фосфорилирования/дефосфорилирования ряда белков (Nayal A. et al., 2004) и их вовлечения в процесс взаимодействия с актином (Zamir E. and Geiger B., 2001). CD44 представлен на поверхности Т- и В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, гранулоцитов, фибробластов, некоторых эпителиальных клетоки принимает участие в клеточно-матриксном взаимодействии, активации лимфоцитов и их миграции в лимфоузлы (Ponta H. et al., 2003). Показана функция CD44 в качестве адгезивной молекулы, взаимодействующей с ВКМ и эндотелием. Цитоплазматический домен CD44 взаимодействует с цитоскелетом (Marhaba R. and ZllerM., 2004). Кадхерины и белки адгезии суперсемейства иммуноглобулинов, обеспечивают кооперацию клеток в процессе коллективной миграции и инвазии (Ilina O. and Friedl P., 2009). Кадхерины участвуют в стабильных и динамических межклеточных контактах и функционируют совместно с цитоскелетными адапторами и сигнальными белками (Friedl P. and Wolf K., 2003; Harris T.J. and Tepass U., 2010). Кадхерины способны как подавлять, так и активировать миграцию клеток (Martinez-Rico C.et al., 2010). Молекулы адгезии суперсемейства иммуноглобулинов (cell-adhesion molecule, САМ) «склеивают» клетки путем гомофильного непосредственного взаимодействия двух молекул и могут участвовать в узнавании клеточной поверхности (Hortsch M. and Goodman C.S., 1991). Некоторые САМ связывают клетки вместе посредством гетерофильного механизма через молекулы межклеточного взаимодействия (intercellular adhesion molecules, ICAM) (Springer T.A., 1990).
Имеются еще ряд молекул, участвующих в адгезии клеток. Мембрана-связанные протеогликаны, например синдеканы и глипиканы, взаимодействуют углеводной частью с компонентами ВКМ. Эти взаимодействия усиливают адгезию в кооперации с интегринами (Couchman J.R., 2010). Группа селектинов, включающая E-селектин, P-селектин и L-селектин, экспрессируется на клетках эндотелия, тромбоцитах и некоторых типах лейкоцитов и играет важную роль в миграции лейкоцитов (Feldner J.C. and Brandt B.H., 2002).
Экспрессия молекул адгезии может регулироваться различными факторами: уровнем внутриклеточного кальция (кадхерины, селектины и большинство интегринов являются кальций-зависимыми), действием внешних агентов, таких как гормоны, ростовые факторы, цитокины, блокаторы кальциевых каналов (Jaeschke H., 1997).
Сокращение актино-миозиновых фибрилл приводит к укорачиванию клеток вдоль оси ориентации фибрилл и генерации натяжения вдоль оси. Контакты клеток с субстратом преимущественно разрушаются в задней части клетки, в то время как фронтальный (мигрирующий) край клеток, присоединен к субстрату и клетка медленно передвигается (скользит) вперед (Palecek S.P. et al., 1997). Организация, сборка и натяжение актин-миозинового цитоскелета контролируется различными регуляторными ферментными системами. MLC киназа и MLC фосфатаза регулируют сокращения миозина посредством модуляции активности его легкой цепи; активность MLC киназы и MLC фосфатазы, в свою очередь, регулируется малыми ГТФ-азами Rho, Rac and CDC42 (Hall A., 1992; Jaffe A.B. and Hall A., 2005).
В норме, клетки склонны формировать множество протрузий, что приводит к хаотическому движению (Reig G. et al., 2014). Хемоаттрактанты, а также компоненты ВКМ, способны формировать направленную клеточную миграцию (Reig G. et al., 2014). Важную роль в направленной миграции клеток играют клеточные контакты. Контакт двух мигрирующих клеток сопровождается остановкой движения в этом направлении, выпячивания в месте контакта сокращаются, появляются новые ламеллоподии на обратной стороне клетки и клетки начинают двигаться в направлении, противоположном контакту клеток (Nakatsuji N. and Johnson K.E., 1983).Такая миграция, индуцированная контактным ингибированием, проявляется при реэпителизации раны и при нанесении «раны» на монослой клеток, когда клетки движутся в свободном от других клеток направлении (Farooqui R. and Fenteany G., 2005).
Направленность движения клеток обеспечивает также хемотаксис, движение по химическому градиенту. Миграция клеток запускается большим количеством хемоаттрактантов, к которым относятся факторы роста, хемокины. Подавляющее большинство мотогенов, кроме влияния на локомоцию культивируемых клеток, способно также влиять на их пролиферацию, являясь, таким образом, одновременно митогенами и мотогенами (Chicoine M.R. and Silbergeld D.L., 1997). Хемоаттрактанты индуцируют внутриклеточную сигнализацию, стимулирующую инициацию полимеризации актина (Xue C. et al., 2006). Предполагается, что градиент хемоаттрактанта вызывает небольшие пространственно/временные различия в активации рецепторов, что приводит в клетке к Rac-опосредованной полимеризации актина и формированию выпячиваний на стороне клетки, контактирующей с наиболее высокими концентрациями хемоаттрактанта (ReigG. et al., 2014).
Флюорохромирование нативного Hsp90
ГСПГ относятся к классу протеогликанов. Все протеогликаны состоят из корового белка, к которому присоединены гликозаминогликаны (Esko J.D. et al., 2009). К гликозаминогликанам относятся: гепаран сульфат (ГС), дерматан сульфат (ДС), кератан сульфат, различные формы хондроитин сульфата (ХС), гепарин и гиалуроновая кислота. Протеогликаны присутствуют на поверхности клеток, в клетках и в экстраклеточном матриксе, содержатся в костях, синовиальной жидкости, стекловидном теле и роговицеглаза, и играют огромную роль во многих биологических процессах (Bourin M.-С. and Lindahl U., 1993; Esko J.D. et al., 2009; Jackson R.L., et al, 1991).
ГСПГ присутствуют в большинстве клеток и тканей млекопитающих, а также низших позвоночных и беспозвоночных (Nader H.B. and Dietrich C.P., 1989). ГСПГ состоят из корового белка и одной или более цепей ГС. ГС представляют собой линейные отрицательно заряженные гетерополисахариды, состоящие из повторяющих дисахаридных единиц N-ацетил-глюкозамина (или N-ацетил-галакозамина) и уроновой кислоты (глюкуроновой или иодуроновой) (Bishop J.R. et al., 2007; Sarrazin S. et al., 2011).
ГС цепи присоединяются к коровому белку в аппарате Гольджи. Синтез ГС инициируется посредством последовательного присоединения остатков ксилозы, галактозы и глюкуроновой кислоты с формированием тетрасахарида GlcA-(pl 3)-D-Gal-(pl 3)-D-Gal-(pl 4)-D-Xyl (Kjellen L. and Lindahl U., 1991). Присоединение следующих сахарных остатков с помощью N-ацетилглюкозамин-трансферазы и N-ацетилгалактозамин-трансферазы определяет, синтезируется ГС или ХС. Обычно к коровому белку присоединяется 30-400 сахарных остатков (Kjellen L. and Lindahl U., 1991). После формирования сахарного остова происходят различные многочисленные модификации гликозаминов: №деацетилирование/N-сульфирование N-ацетилгликозаминов, эпимеризация гликозаминов до L-иодуроновой кислоты, сульфирование L-иодуроновой кислоты и N-ацетилгликозаминов (Sarrazin S. et al., 2011). Наблюдается значительная структурная гетерогенность ГС в части размера и длины полисахаридной части, положения и типа модификаций полисахаридов, уровня сульфирования и эпимеризации (Esko J.D. and Selleck S.B., 2002). Большинство ГСПГ несут ГС сходной общей структуры -сульфированные домены перемежающиеся регионами с низким сульфированием. Условия роста клеток и ростовые стимулы влияют на степень сульфирования ГС в ГСПГ (Esko J.D. and Selleck S.B., 2002). Распределение сайтов сульфирования углеводных мономеров, степень эпимеризации и последующие модификации зависят, в основном, не от типа корового белка, а от типа клеток, в которых экспрессируется ГСПГ (Kato M. et al., 1994).
Коровый белок ГСПГ определяет, локализован ли белок на поверхности клеток, или во внутриклеточных гранулах тучных клеток, или во внеклеточном матриксе (Kjellen L. and Lindahl U., 1991), в то время как ГС определяет связывание ГСПГ с различными лигандами (Lindahl U. et al., 1998). Большие вариации в количестве, длине и модификациях полисахаридных цепей ГСПГ приводят к огромной полидисперсности ГСПГ и большому разнообразию лигандов, с которыми они связываются (Esko J.D. and Selleck S.B., 2002).
ГСПГ можно разделить на три субсемейства, в зависимости от типа корового белка: интегральные мембранные ГСПГ (синдеканы, бетагликаны и CD44v3), гликофосфатидилинозитол (GPI)-связанные ГСПГ (глипиканы) и секретируемые ГСПГ внеклеточного матрикса (агрин, коллаген XVIII и перлекан) (Bernfield M. et al., 1999; Sarrazin S. et al., 2011). Бетагликан и нейропилин-1, содержат одну или редко две цепи гликозаминогликана (ГС/ХС) и могут существовать как с, так и без гликозаминогликанов («partime» ГСПГ) (Tumova S. et al., 2000).
К мембранным ГСПГ относят синдеканы и глипиканы (Bernfield M. et al., 1999) (Рис. 3). У позвоночных, семейство синдеканов включает четыре представителя: синдекан-1, синдекан-2 (фиброгликан), синдекан-3 (N-синдекан) и синдекан-4 (амфигликан) (Bernfield M. et al., 1999), которые являются трансмембранными белками и могут присоединять к белковому кору до пяти цепей гликозаминогликанов (Bernfield M. et al., 1999). Хотя цитоплазматические и трансмембранные домены различных синдеканов схожи, их внеклеточные домены разнообразны (Tumova S. et al., 2000). В синдеканах преимущественно обнаруживаются ГС цепи. В отдельных случаях в синдеканах присутсвуют хондроитинсульфатные и/или дерматансульфатные цепи, отличающиеся от ГС по составу полисахаридных цепей и типу их модификаций (Sarrazin S. et al., 2011).
Изучение влияния различных ингибиторов и ферментов на мембранную экспрессию Hsp90
Показано, что в исследованных концентрациях очищенный нативный суммарный Hsp90 из мозга мыши и препараты двух изоформ Hsp90, Hsp90 и Hsp90, не обладали прямой цитотоксичностью и не влияли на пролиферацию клеток глиобластомы и фибросаркомы человека вплоть до концентраций 1 мг/мл. Это согласуется с данными литературы о том, что Hsp90 не обладает стимулирующим эффектом на пролиферацию клеток (Cheng C.F. et al., 2008; Li W. et al., 2007; Woodley D.T., et al., 2009).
Таким образом, на начальном этапе работы был разработан метод очистки суммарного Hsp90 с помощью тиофильной хроматографии, который позволил нам нарабатывать образцы нативного суммарного Hsp90 из мозга мыши с чистотой до 97%. Образцы очищенного Hsp90 содержали обе изоформы Hsp90 в соотношении 40% Hsp90 и 60% Hsp90. С использованием иммуноаффинной хроматографии получены препараты нативных Hsp90 и Hsp90, чистота которых составляла не менее 98%. Суммарный препарат Hsp90 и препараты двух изоформ нативного Hsp90, Hsp90 и Hsp90, не проявляли токсичности для клеток А-172 и HT1080 и не влияли на пролиферацию клеток этих культур. Полученный очищенный препарат нативного Hsp90 использовали для очистки двух изоформ Hsp90 (Hsp90 и Hsp90), а также для иммунизации животных с целью получения Hsp90-специфических антител. Кроме этого, препараты Hsp90, Hsp90 и Hsp90, использовали в экспериментах по изучению роли отдельных изоформ Hsp90 в стимуляции миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro. 3.2. Получение и характеристика Hsp90-специфических поликлональных антител
Следующий этап работы был посвящен получению поликлональных антител к полноразмерной молекуле Hsp90, а также к отдельным изоформам Hsp90, Hsp90 и Hsp90. Препараты антител использовали в экспериментах по изучению роли мембрана-ассоциированных Hsp90 в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro, иммунофлуоресцентного окрашивания мембрана-ассоциированных Hsp90, Hsp90 и Hsp90 и для синтеза Hsp90-специфических иммуноаффинных сорбентов.
С помощью специальных программ и баз данных (Immune Epitope Database and Analysis Resource, ISPRI Web-based Immunogenicity Screening) был проведен анализ аминокислотных последовательностей двух изоформ Hsp90 млекопитающих и выбраны потенциально иммуногенные пептиды из разных областей Hsp90. Были синтезированы пептиды, соответствующие N-концевым фрагментам Hsp90 (PEETQTQDQPM) и Hsp90 (EEVHHGEEEVE) человека и мыши, не имеющие гомологии между собой, а также пептид LNKTKPIWTRNP, одинаковый для обеих изоформ Hsp90 и соответствующий фрагменту среднего домена молекулы Hsp90 (236-350 а.о.). У всех пептидов на С-конце вводили дополнительный цистеин для конъюгирования с белками с использованием гетеробифункционального кросс-линкера Sulfo-SMCC. Пептиды конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (БСА), овальбумином и гемоцианином с использованием Sulfo-SMCC в соответствии с рекомендациями производителя (Pierce). Подробно получение конъюгатов пептидов с белками описано в разделе 2.4.1. Получение конъюгатов контролировали с помощью электрофоретического анализа по изменению молекулярной массы белков-носителей (для БСА и овальбумина). После конъюгирования молекулярная масса белков-носителей увеличивалась на 5-7 кДа, что свидетельствовало об эффективной пришивке пептидов к белкам (Рис. 8). С учетом изменения молекулярной массы конъюгатов и массы исходных пептидов, к одной молекуле белка присоединялось 3-5 молекул пептида.
Для получения Hsp90-специфических антител, кроликов иммунизировали препаратами очищенного суммарного нативного Hsp90 из мозга мыши, а также белковыми конъюгатами на основе Hsp90-специфических пептидов. Было проведено 6-8 иммунизаций животных, с интервалами в две недели. Детали иммунизации описаны в разделе 2.4.3. После каждой иммунизации, начиная с четвертой иммунизации, в сыворотках животных определяли титры Hsp90-специфических антител методом непрямого ИФА с использованием нативного Hsp90 для сенсибилизации 96-луночных планшет, как описано в разделе 2.8.1. 72 кДа 54 кДа 43 кДа
После 5-7 иммунизаций животных, полученные гипериммунные сыворотки реагировали с Hsp90 в непрямом ИФА – титр сывороток составлял не менее 1:200 000; с контрольными белками сыворотки не реагировали – оптическая плотность (А450) при разведении сывороток 1:200 не превышала 0,2 единиц адсорбции.
Для иммуноаффинной очистки Hsp90-специфических антител изготавливали специфические сорбенты с иммобилизованными пептидными фрагментами Hsp90 или с полноразмерным Hsp90. Пептидные фрагменты конъюгировали с носителем Sulfo-Link Resin (Thermo Scientific) по С-концевому цистеину. Hsp90 конъюгировали на Сефарозу CL-6B, активированную перйодатом натрия. Детально методики синтеза аффинных пептидных и белковых сорбентов описаны в разделе 2.4.2. Далее, с использованием полученных нами специфических носителей с иммобилизованными пептидными фрагментами и полноразмерным нативным Hsp90, из сывороток очищали Hsp90-специфические антитела методом иммуноаффинной хроматографии. Методика иммуноаффинной очистки Hsp90-специфических антител из полученных сывороток описана в разделе 2.4.4. В результате иммуноаффинной очистки, были получены препараты очищенных антител, направленных к N-концевому пептиду Hsp90, N-концевому пептиду Hsp90, пептиду среднего домена Hsp90, одинаковому у Hsp90 и Hsp90, и антитела к полноразмерному нативному Hsp90 мыши (Hsp90full). Чистота препаратов антител составляла не менее 95%, согласно данным электрофореза в ПААГ (Рис. 9А). Специфичность полученных антител анализировали методом Вестерн-блот анализа (Рис. 9Б). Все антитела специфически выявляли Hsp90 в Вестерн-блоте в лизатах клеток человека НТ1080. Активность и специфичность антител, очищенных с помощью иммуноаффинной хроматографии, также определяли методом непрямого ИФА. Титры антител, полученных к Hsp90, Hsp90, Hsp90 и полноразмерному нативному Hsp90full, на нативном Hsp90 составляли 1:500 000-1:2 000 000, что свидетельствовало о высокой активности Hsp90 72 специфических антител. Аффинно-очищенные антитела к Hsp90a, Hsp90p, Hsp90aP и Hsp90full не реагировали с Hsp70 мыши, БСА и ОВА, что свидетельствует о специфичности полученных антител (Таблица 6).
Роль клеточных гепарансульфат протеогликанов в миграции и инвазии опухолевых клеток in vitro
Во второй модели мы оценивали восстановление мембрана-ассоциированных Hsp90 и Hsp90 после обработки клеток гепарином. Как мы упоминали ранее, после обработки клеток гепарином, гепарин-устойчивая часть мембрана-ассоциированных Hsp90a и Hsp90p оставалась на плазматической мембране клеток, в то время, как фракция гепарин-чувствительных Hsp90a и Hsp90p (40-80% от всех поверхностных Hsp90a и Hsp90p) откреплялась от поверхности клеток (раздел 3.5.2., Рис. 22). Мы полагали, что ингибирование транслокации новых Hsp90 и Hsp90 на плазматическую клеточную мембрану может привести к блокированию процесса восстановления уровня двух изоформ Hsp90 на мембране.
В работе исследовали действие различных ингибиторов синтеза и секреции белков на мембранную экспрессию Hsp90: брефелдина А, классического ингибитора ЭПР/Гольджи-зависимого пути секреции белков, который блокирует транспорт полипептидов из ЭПР в аппарат Гольджи и, тем самым, регулирует транспорт белков через вакуолярную систему (Klausner R.D. et al., 1992); монензина, Na+/H+ ионофора, который блокирует транспорт в аппарате Гольджи и, тем самым, классический путь секреции белков (Mollenhauer H.H. et al., 1990); метил--циклодекстрина, ингибитора формирования липидных рафтов (Hao Q. et al., 2007); хлорида аммония, лизосомотропного агента, повышающего уровень рН внутри лизосом и ингибирующего лизосомальную секрецию (Dean R.T. et al., 1984); GW4869, ингибитора нейтральной сфингомиелиназы, участвующей в формировании и выходе экзосом из клеток (Yuyama K. et al., 2012); диметил амилорида, ингибитора экзосомальной секреции (Savina A. et al., 2003), а также циклогексимида, ингибитора белкового синтеза (HettingerT.P. et al., 2007). При используемых концентрациях и временах инкубации с клетками (30 мин для циклогексимида и 2 ч для остальных ингибиторов), ни один из ингибиторов не оказывал токсического действия на клетки А-172 и НТ1080.
На двух клеточных культурах было показано, что инкубация клеток в присутствии брефелдина А, монензина, хлорида аммония, метил--циклодекстрина не влияла на уровень мембрана-ассоциированных Hsp90 и Hsp90 (Таблица 9). Это свидетельствовало, что классический ЭПР/Гольджи-зависимый путь секреции белков, лизосомальный путь секреции белков, а также липидные рафты не участвуют в транслокации Hsp90 и Hsp90 на плазматическую мембрану. Циклогексимид также не влиял на уровень мембрана-ассоциированных Hsp90 и Hsp90; это свидетельствует, что для транслокации Hsp90 и Hsp90 на плазматическую мембрану не требуется синтеза Hsp90 de novo (Таблица 9).
Обработка клеток GW4869 снижала уровень двух изоформ Hsp90 на 40-60% в клетках А-172, но не изменяла уровень мембрана-ассоциированных Hsp90a и Hsp90p в НТ1080 (Таблица 9). Напротив, ДМА снижал уровень мембранных Hsp90a и Hsp90p на 75-80% в клетках НТ1080, но не экспрессию мембрана-ассоциированных Hsp90a и Hsp90p в А-172 (Таблица 9). Хотя эффекты GW4869 и ДМА были различны на двух клеточных культурах, в целом, результаты указывали на важную роль экзосомального пути секреции белков в транслокации Hsp90a и Hsp90p на плазматическую клеточную мембрану.
При инкубации клеток, обработанных гепарином, в полноценной среде без гепарина, практически полное восстановление уровня мембранной экспрессии обеих изоформ Hsp90 достигалось за 1 ч (раздел 3.5.3.). Для двух клеточных культур было показано, что добавление в среду таких ингибиторов как брефелдин А, монензин, метил-Р-циклодекстрин и хлорид аммония во время 1 -часового периода восстановления не сказывалось на динамике восстановления уровня Hsp90a и Hsp90P на поверхности клеток. Это свидетельствовало, что классический ЭПР/Гольджи-зависимый и лизосомальный пути секреции белков, а также липидные рафты не участвуют в транслокации двух изоформ Hsp90 на плазматическую мембрану клеток, после обработки клеток гепарином. Циклогексимид частично ингибировал восстановление на мембране Hsp90a, но не влиял на восстановление Hsp90p. Инкубация клеток в присутствии ингибиторов экзосомальной секреции белков приводила к выраженному ингибированию восстановления уровня мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90. Для клеток глиобластомы человека ДМА и GW4869 снижали восстановление уровня Hsp90a и Hsp90p на 30-60%от уровня контрольных клеток без ингибиторов. ДМА и GW4869 полностью блокировали восстановление уровня мембрана-ассоциированных Hsp90a и Hsp90p после обработки гепарином клеток фибросаркомы человека (Таблица 10). Для обеих клеточных культур, сочетание двух ингибиторов экзосомальной секреции, ДМА и GW4869, полностью блокировало восстановление уровня мембранной экспрессии двух изоформ Hsp90 на плазматической мембране клеток, после их обработки гепарином, свидетельствуя о важной роли экзосомального пути секреции в транслокации Hsp90a и Hsp90P на мембрану.