Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность эукариотических клеток к направленной миграции и хемотаксису играет важную роль в процессах эмбриогенеза, ангиогенеза, нейрогенеза и репарации поврежденных тканей. Множество патологий и заболеваний, включая рак, атеросклероз и воспалительные реакции связаны с нарушением клеточной подвижности и, преимущественно, с повышением миграционной активности клеток. Поэтому установление механизмов регуляции двигательной активности клеток и определение основных ее регуляторов является важной задачей для понимания физиологии и патофизиологии этих процессов.
Связывание хемоаттрактанта с поверхностными рецепторами запускает направленную миграцию клетки. Сигнал от связывания хемоаттрактанта передается каскадным путем к экспрессирующемуся во всех клетках белку актину, который реализует двигательные, сократительные и адгезивные реакции клеток. Усиленная полимеризация актина в филаменты определяет формирование листообразных (ламеллиподий) и иглообразных (филоподий) протрузий на переднем крае клетки, которые обеспечивают перемещение клетки. Другим важным фактором, контролирующим миграцию клеток, является сократимость актиновых стресс-фибрилл, содержащих моторный белок миозин II типа и обеспечивающих адгезию клетки и подтягивание ее тела и хвостовой части.
Различные актин-связывающие белки контролируют структуру актина и его взаимодействие с миозином, регулируя, таким образом, скорость миграции клеток. Кальдесмон - это многофункциональный белок, который взаимодействует с актином и миозином и влияет как на структуру актина, так и на моторную активность актомиозина. Он стабилизирует полимерный актин, изменяет скорость его полимеризации и механические свойства, ингибирует АТФазу актомиозина и, таким образом, может тормозить подтягивание тела клетки в процессе движения. Однако несмотря на многочисленные биохимические данные, предполагающие регуляторную функцию кальдесмона, до сих пор остается неясным как и насколько влияет кальдесмон на скорость движения живой клетки.
Некоторые данные указывают на способность кальдесмона влиять на движение клетки. Сверхэкспрессия кальдесмона в культивируемых эндотелиальных и гладкомышечных клетках приводит к снижению их направленной миграции (Mirzapoiazova et al., 2005; Yokouchi et al., 2006), а в фибробластах оказывает двоякий эффект, как уменьшая, так и увеличивая скорость миграции (Surgucheva and Bryan, 1995). Показано, что кальдесмон влияет на силу адгезии клеток, образование подосом, организацию кортикального цитоскелета и стабильность микрофиламентов актина (Helfman et al., 1999; Eves et al., 2006; Mirzapoiazova et al., 2005; Warren et al., 1996). Кальдесмон регулирует активность других актин-связывающих белков,
таких как гельзолин и тропомиозин, фасцин, Агр2/3, что опосредовано влияет на динамику внутриклеточного актина (Ishikawa et al., 1989; Ishikawa et al., 1998; Yamakita et al., 2003). Однако вклад этих изменений в скорость движения клеток остается неясным.
Известно, что фосфорилирование регулирует связывание кальдесмона с актином. В немышечных клетках оно изменяет активность кальдесмона в подосомах, кортикальном цитоскелете и стресс-фибриллах (Gu et al., 2007; Eppinga et al., 2006; Kordowska et al., 2006). В гладкомышечных клетках кальдесмон, в основном, фосфорилируют МАР-киназы,
yen 7SQ
модифицируя два остатка (Сер и Сер ), расположенные в С-концевом домене вблизи от
7 СП
участков связывания актина. Долгое время основным считался остаток Сер и последствия его фосфорилирования были детально исследованы in vitro (Redwood et al., 1993; Patchell et al., 2002). Однако позднее стало ясно, что в клетках преимущественному фосфорилированию подвергается остаток Сер , в том числе в процессе хемотаксиса (Goncharova et al., 2002). Тем не менее, остается неясным, как фосфорилирование Сер влияет на активность кальдесмона in vitro, а также является ли оно необходимым для ускорения миграции клеток, или происходит параллельно и независимо.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснить, какой вклад вносит кальдесмон и его фосфорилирование МАР-киназами в скорость миграции немышечных клеток, и определить, в каких клеточных компартментах реализуется его действие. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Определить эффект фосфорилирования кальдесмона по остатку Сер на связывание кальдесмона с актином и способность регулировать активность АТФазы актомиозина in vitro.
Разработать экспериментальную клеточную модель с пониженным уровнем экспрессии кальдесмона и определить насколько кальдесмон влияет на скорость миграции клеток.
Определить как кальдесмон влияет на организацию актинового цитоскелета на лидирующем крае мигрирующих клеток, сборку стресс-фибрилл внутри клеток и адгезию клеток.
Оценить влияние фосфорилирования кальдесмона МАР-киназами на скорость миграции фибробластов.
Научная новизна работы. Впервые в условиях in vitro исследованы эффекты фосфорилирования Сер кальдесмона. Установлено, что фосфорилирование остатка Сер приводит к ослаблению взаимодействия кальдесмона с F-актином и значительно подавляет способность кальдесмона ингибировать АТФазу актомиозина. Показано, что фосфорилирование Сер и взаимодействие кальдесмона с комплексом Са -кальмодулин дает синергичный эффект в устранении ингибиторной активности кальдесмона. Установлено, что 5-10 кратное снижение экспрессии кальдесмона в клетках HeLa 1469 и ЗТЗ фибробластах
вызывает ускорение спонтанной и стимулированной хемоаттрактантами миграции клеток. Обнаружено, что подавление экспрессии кальдесмона приводит к изменению структуры актина на лидирующем крае, уменьшению времени жизни ламеллиподий и нарушению сборки стресс-фибрилл в теле клетки. Фосфорилирование Сер кальдесмона МАР-киназами не является критичным условием для PDGF-стимулированной миграции фибробластов.
Практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию механизмов регуляции миграции немышечных клеток, проясняют роль кальдесмона в регуляции актин-зависимых механизмов движения клеток и фосфорилирования этого белка МАР-киназами в процессе миграции. Результаты, полученные in vitro, показывают каким образом фосфорилирование кальдесмона по Cep/sy MAP -киназами, наблюдаемое in vivo, регулирует актин и актомиозиновый мотор клетки. Эти данные позволяют предполагать, что актомиозин-зависимая сократимость не лимитирует движение фибробластов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на совместном заседании кафедры Биохимии биологического факультета и кафедры Биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, а также на на международных симпозиумах "Биологическая подвижность" (Пущино, Россия, 2006 и 2008), на 35й и 37й Европейских мышечных конференциях (Гейдельберг, Германия, 2006; Оксфорд, Великобритания, 2008), на Международном студенческом форуме (Омаха, США 2008), и на 6м симпозиуме имени Аберкромби по клеточной миграции (Оксфорд, Великобритания, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок. Список литературы включает 269 источников.
