Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Понятие адаптации. Биохимические адаптации . 12
1.2 Роль липидов в арктических экосистемах: особенности накопления и передачи липидов по пищевым цепям . 16
1.2.1 Калянусы Calanus glacialis, Calanusfinmarchicus —доминирующие виды морских экосистем Арктики и основные объекты питания мальков люмпена пятнистого L. maculatus 22
1.3 Липиды арктических рыб . 25
1.3.1 Фосфолипиды, их функциональное значение в организме арктических рыб ... 25
1.3.1.1 Фосфатидилхолин и фосфатидилэтоноламин 27
1.3.1.2 Сфингомиелин, лизофосфатидилхолин и другие фосфолипиды . 28
1.3.2 Холестерин - один из основных компонентов клеточных мембран 30
1.3.3 Триацилглицерины и восковые эфиры - основные запасные липиды арктических организмов . 32
1.3.4 Жирные кислоты, их функциональное значение в организме рыб 34
1.4 Люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus: биология и распространение в Арктике 40
1.4.1 Липидный мешок мальков люмпена пятнистого - особый орган для депонирования липидов . . 48
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований
2.1 Район сбора проб - акватория архипелага Свалбард, о. Шпицберген 51
2.2 Материал и его фиксация . . 58
2.3 Методы исследований 58
2.3.1 Экстракция липидов ...
2.3.2 Тонкослойная хроматография .
2.3.2.1 Разделение липидов .
2.3.3 Количественное определение липидов (общих и индивидуальных)
2.3.4 Количественное определение холестерина .
2.3.5 Определение фосфолипидного состава методом ВЭЖХ
2.3.6 Определение спектра жирных кислот методом газожидкостной хроматографии .
2.3.7 Расчеты количества липидов в пробе .
2.3.8 Статистическая обработка результатов. ...
2.3.9 Подготовка гистологических проб ...
2.3.9.1 Проводка и заливка материала . ...
2.3.9.2 Резка блока на микротоме и приготовление парафиновых и желатиновых срезов .
2.3.9.3 Окраска и заливка препарата в заливочную среду .
2.3.9.4 Гистохимия липидов .
2.3.10 Световая микроскопия и компьютерная обработка гистологического материала .
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1 Содержание общих липидов, фосфолипидов, индивидуальных фосфолипидов и жирных кислот в мышцах и жировом мешке мальков люмпена пятнистого из трех биотопов (Исфиорд, Конгсфиорд, V10) северо-западного побережья о. Шпицберген ...
3.2 Содержание общих липидов, фосфолипидов, индивидуальных фосфолипидов и жирных кислот в мышцах, печени и гонадах взрослого люмпена пятнистого из трех биотопов (КВ1, КВЗ, VI0) северо-западного побережья о. Шпицберген...
3.3 Сезонная динамика общих липидов в женских гонадах и печени взрослого люмпена пятнистого в процессе оогенеза. Биохимический анализ .
3.4 Особенности накопления и локализации липидов в тканях и органах мальков и взрослых особях L. maculatus (гистологический анализ)
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
Заключение
Выводы
Список литературы
Приложение
- Роль липидов в арктических экосистемах: особенности накопления и передачи липидов по пищевым цепям
- Люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus: биология и распространение в Арктике
- Район сбора проб - акватория архипелага Свалбард, о. Шпицберген
- Содержание общих липидов, фосфолипидов, индивидуальных фосфолипидов и жирных кислот в мышцах и жировом мешке мальков люмпена пятнистого из трех биотопов (Исфиорд, Конгсфиорд, V10) северо-западного побережья о. Шпицберген
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из центральных проблем биологии является проблема устойчивости организма и его адаптации к изменяющимся факторам среды. Адаптации обеспечиваются деятельностью целого комплекса механизмов, среди которых особую роль играют биохимические механизмы, лежащие в основе развития компенсаторных реакций клетки (Хочачка, Со-меро, 1988). При изменении условий среды или переходе организма на новую стадию развития возникают новые задачи, для решения которых необходимо учитывать количественные и качественные изменения в биохимическом метаболизме, как отдельного органа, так и всего организма.
Липиды и жирные кислоты выполняют важные функции в клеточном метаболизме и играют существенную роль в биохимических адаптациях у арктических видов (Cossins & Prosser, 1978; Lund & Sidell, 1992; Stuart et al., 1998; Аракелова и др., 2004). Они служат не только источниками энергии в организме, но и являются необходимыми структурными компонентами клеточных мембран. Отличия липидов морских организмов, обитающих в арктических широтах, от липидов гидробионтов умеренных широт, являются не столько качественными, сколько количественными. Условия существования незначительно сказываются на наборе определенных типов липидов, что подтверждает их генетическую детерминированность (Крепе, 1981). Содержание липидов в организме отражает экологические особенности жизни рыб, а данные о сезонной, популяционной и межгодовой изменчивости позволяют оценить их значение в различные периоды их жизненного цикла. Функциональные свойства липидов во многом определяются жирнокислотными цепями, которые входят в их состав, являются наиболее лабильными компонентами и сравнительно быстро включаются в процессы развития адаптивных реакций. Сравнительное изучение спектров жирных кислот позволяет детально и многогранно оценить роль липидных компонентов в адаптациях арктических и субарктических видов рыб к условиям Севера.
Объектом исследования был выбран типичный арктический вид - люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus (Fries 1838), мальки и взрослые особи которого широко представлены в арктических водах северной Норвегии вплоть до 80 с.ш. при температуре ниже 0 С. Данный вид хорошо приспособлен к жизни в суровых условиях Арктики с сезонной сменой ряда абиотических факторов. Известно, что для разных видов морских птиц и млекопитающих Leptoclinus maculatus является основным объектом питания. Он занимает двойную нишу в арктических трофических цепях, выступая одновременно в роли и хищника, и жертвы (Falk-Petersen et al., 2008). Биология и экология люмпена пятнистого изучены недостаточно. Известно, что до трехлетнего возраста мальки обитают в пелагиали, затем медленно опускаются на дно, полностью
меняя среду обитания, образ жизни и тип питания. Биохимические адаптации к этим факторам не могут не включать изменений в липидном статусе рыб. Следует отметить, что данные о динамике состава липидов и жирных кислот в жизненном цикле люмпена пятнистого очень немногочисленны. Такого рода исследования могут иметь несомненное значение не только для понимания фундаментальных основ роли биохимических адаптации в приспособлении водных организмов к жизни в условиях высоких широт, но и для использования при решении прикладных задач, связанных с повышением продуктивности ценных промысловых видов рыб в арктическом и субарктическом регионе, для которых люмпен пятнистый является одним из главных пищевых объектов.
Цель работы: изучение роли липидного и жирнокислотного состава тканей и органов пелагических мальков и донных взрослых особей арктического вида Leptoclinus maculatus F. (люмпена пятнистого) в различных эколого-физиологических ситуациях.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать содержание общих липидов и их отдельных классов (триацилглицеринов, холестерина, восковых эфиров, общих фосфолипи-дов и фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, лизофосфатидилхолина, фосфатидилинозитола, сфингомиелина, а также жирных кислот общих липидов) в мышцах и жировом мешке мальков, печени, мышц и гонадах взрослых особей люмпена пятнистого, взятых для анализа из трех разных биотопов Северо-западного побережья о. Шпицберген;
Изучить состояние липидного мешка и мышц мальков люмпена пятнистого из трех разных биотопов северо-западного побережья О.Шпицберген с использованием методик гистологического анализа;
Выявить особенности накопления липидов в оогенезе люмпена пятнистого в условиях Арктики в сезонном аспекте на основе гистологического анализа печени и гонад самок;
Установить особенности биохимических адаптации на уровне липидного статуса у исследуемых рыб, в зависимости от разных абиотических, биотических и физиологических факторов (температуры, питания, развития, сезонности, двигательной активности и др.).
Научная новизна. Впервые исследован липидный и жирнокислотный состав мальков и взрослых особей люмпена пятнистого L. maculatus северо-западного побережья о. Шпицберген в летний сезон. Проведено изучение суммарного содержания липидов и их отдельных классов, а также жирных кислот рыб в зависимости от экологических и физиологических факторов: установлена связь между жирностью органов и стадией зрелости гонад, исследованы
особенности накопления липидов в гонадах взрослых самок, установлены возможные сроки икрометания и выклева мальков люмпена пятнистого в арктическом регионе, исследована связь между питанием и содержанием липидов в органах мальков и взрослых особей L. maculatus, исследованы особенности жизненного цикла рыбы в летний арктический сезон северо-западного побережья о. Шпицберген (3 отдельных биотопа). Ранее такие работы на данном объекте не проводились. Выполненные исследования позволили получить новую информацию о липидном составе мальков и взрослых особей люмпена пятнистого, что дает возможность проследить пути трансформации и перемещения липидов по звеньям пищевой цепи. На защиту выносятся:
результаты биохимического и гистологического анализа мышц и ли-пидного мешка мальков, а также мышц, печени и гонад взрослых особей люмпена пятнистого северо-западного побережья О.Шпицберген;
закономерности ускоренного накопления липидов в тканях и органах гидробионтов Арктики;
существенность влияния липидных компонентов объектов питания на жирнокислотный состав тканей и органов мальков и взрослых особей люмпена пятнистого.
Практическое значение работы. Результаты детального изучения биологии и биохимии (липидного и жирнокислотного состава) одного из ключевых видов Арктики и Субарктики - Leptoclinus maculatus, играющего важнейшую роль в питании ценных видов арктических рыб (полярная треска, камбала), могут быть использованы в постановке и решении различных практических задач, связанных с повышением продуктивности ценных промысловых видов рыб в арктическом регионе. Кроме того, полученные в работе данные о биохимических адаптациях липидного и жирнокислотного состава люмпена пятнистого могут иметь значение в проведении мониторинговых исследований состояния рыб Арктики и Субарктики в условиях изменяющихся факторов среды, в том числе климатических и антропогенных. Материалы диссертации можно использовать в учебном процессе при чтении лекционных курсов «Экологическая биохимия» и «Биохимия животных» для студентов биологических факультетов университетов.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на международных, всероссийских конференциях и коллоквиумах (7 устных и 11 стендовых презентаций): международной конференции «Arctic Frontiers» (Troms0, 2007, 2008, 2009, 2010), 2-ой научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Всероссийской конферен-
ции с международным участием «Северные территории России: проблемы и перспективы развития» (Архангельск, 2008), международной конференции SCAMASC IPY Open Science Conference Polar research-Arctic and Antarctic Perspective in the International Polar Year (Санкт-Петербург, 2008), 49th ICBL (Maasticht, 2008), Российско-польской школе-конференции молодых экологов Arctic and sub-Arctic region: ecological research work (Zacopane, 2008), XVIII Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского севера» (Петрозаводск, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из которых 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, 3 статьи в других изданиях и 11 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, 4 глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 101 рисунок. Список цитируемой литературы включает 195 названий, из них 123 иностранных.
Роль липидов в арктических экосистемах: особенности накопления и передачи липидов по пищевым цепям
Проблема устойчивости организма, его адаптации к изменяющимся факторам среды остается одной из центральных проблем биологии. Различными отечественными и иностранными авторами дано множество определений адаптации, которые, в конечном счете, можно свести к понятию адаптации как совокупности реакций биологической системы, поддерживающих ее функциональную устойчивость при изменении условий окружающей среды (Немова, Высоцкая, 2004). Понятие адаптации охватывает широкий круг вопросов приспособления организма к условиям среды. Проблема механизмов приспособления к условиям среды стоит в центре многих общебиологических дисциплин, поскольку она затрагивает ряд фундаментальных свойств живых организмов. Несмотря на большое разнообразие типов, уровней, механизмов адаптации, их можно рассматривать как переходный процесс, вызванный сменой среды или отдельных ее факторов: переход живой системы любого уровня организации из одного устойчивого состояния в другое (Озернюк, 2003). Адаптации к условиям окружающей среды как универсальное явление формируются и проявляются на самых различных уровнях организации живого: от молекулярного до биоценотического (Озернюк, 1992). Понятие «адаптация» вбирает в себя три основных явления. Первое — это процесс приспособления особи к изменяющейся среде, т.е. изменение физиологических, биохимических, поведенческих и других показателей. Второе - это становление вида в изменяющейся среде, и третье - образование дополнительного механизма (механизмов) существования в среде (Озернюк, 2003; Смирнов, Богдан, 2007). Приспособления к отдельным факторам среды или к комплексу природных условий, проявления их на онтогенетическом или эволюционном уровнях с участием разных механизмов, относительность состояния адаптированности позволяют считать способность к приспособлению одним из наиболее общих свойств живых существ (Озернюк, 1992). При этом явление адаптации рассматривают как переходный процесс между существованием в прежних и новых условиях среды. Главнейшими особенностями адаптации являются: фазность, системный характер и относительность состояния приспособления (Хочачка, Сомеро, 1977). Термин «адаптация» в обычном понимании слишком эластичен и имеет специфический смысл для каждой области биологии: «фенотипическая», «физиологическая», «эволюционная», «генетическая» адаптация (Хочачка, Сомеро, 1977; Крепе, 1981). Адаптация рассматривается, как способность организмов приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды с одновременным повышением вероятности выживания и самовоспроизведения (Немова, Высоцкая, 2004).
Целью нашего исследования являются «биохимические адаптации», наиболее полно обсуждаемые в трудах П. Хочачки и Дж. Сомеро (1977). Авторы сосредоточили свое внимание на биохимических механизмах, определяющих качественное и количественное своеобразие метаболических функций организмов. Все адаптивные процессы базируются на биохимической адаптации, то есть свойстве живых систем приспосабливаться к изменчивым условиям среду через модификацию биохимического состава и метаболических реакций (Хочачка, Сомеро, 1977). Биохимические адаптации направлены на: сохранение целостности и функциональной активности макромолекул и надмолекулярных комплексов; обеспечение организма источниками энергии и питательными веществами, необходимыми для биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов; поддержание регуляторных механизмов обмена веществ и его изменений в зависимости от непостоянных условий среды. Биохимические изменения адаптивны большей частью на уровне основных метаболитических функций и поэтому макроскопически не проявляются.
Биохимические адаптации организма к изменяющимся факторам среды могут быть выражены в трех основных типах биохимического ответа: приспособление макромолекулярных компонентов клеток и (или) жидкостей организма; приспособление микросреды, в которой функционируют макромолекулы; функциональные приспособления - изменение эффективности макромолекулярных систем (особенно, ферментов и ферментных ансамблей), не связано с изменением числа имеющихся в клетке макромолекул или их типов (Хочачка, Сомеро, 1977). Все перечисленные типы четко не разграничены и взаимодополняющи. Над всеми этими метаболическими функциями или, точнее, над обуславливающими их последовательностями реакций надстроена эффективная система регуляции, приводящая каждый отдельный метаболический процесс, к строгому соответствию нуждам организма в целом. Ни один путь обмена не работает автономно, независимо от остального метаболизма клетки (Немова, Высоцкая, 2004).
Устойчивость организма к различным воздействиям в значительной степени определяется особенностями липидного обмена. Липидам присущи три основные функции. Это важнейшие структурные компоненты клеточных мембран, форма запасов метаболического топлива, а также важнейшие биоэффекторы, регулирующие внутриклеточные биохимические реакции и межклеточные взаимодействия, и различные физиологические процессы, происходящие в организме (Крепе, 1981; Дятловицкая, Безуглов, 1998; Немова, 2005).
Механизмы биохимических адаптации П. Хочачка и Дж. Сомеро подразделяют на два класса: компенсаторные и эксплуативные. Если в результате воздействия какого либо фактора в организме происходят биохимические изменения, приводящие к восстановлению функциональных особенностей до их прежденего уровня, то такие адаптации называют «компенсаторными». Если биохимические изменения открывают перед организмом новые возможности в использовании своей среды или освоении новой, то такой тип адаптации называют «эксплуативным» (Озернюк, 1992; Немова, Высоцкая, 2004).
Границы, внутри которых возможно приспособление к окружающим условиям, составляют основу глобального процесса взаимодействия организма и среды и являются так называемым «экологически пределом» процессов жизнедеятельности (Озернюк, 1992; Карамушко, 2007). Разнообразие и совершенство адаптационных механизмов позволяет организмам заселять различные экологические ниши, в том числе в таких суровых условиях, которые сложились в Арктике. Изучение механизмов развития адаптации у гидробионтов высоких широт к комплексу экологических факторов среды (из которых одним из важнейших являются низкие температуры) позволят оценить их способность к эффективному приспособлению к жизни в этих условиях.
Известно, что изменение метаболизма липидов, как наиболее важных энергетических компонентов имеет важное значение для адаптации северных гидробионтов и носит важный адаптивный характер. Изучение состава, функции и роли липидов и их жирнокислотных компонентов в организме арктических рыб, а также процессов трансформации и передачи липидов по пищевым цепям арктических экосистем имеет существенное значение для понимания вопроса об оптимальном функционировании всех метаболических систем организма в условиях изменяющихся факторов среды (суточных, сезонных, межгодовых и прочих).
Люмпен пятнистый Leptoclinus maculatus: биология и распространение в Арктике
Липиды рыб, главным образом их жирные кислоты - основной источник метаболической энергии для их роста, развития, репродукции и плавания, особенно у тех, которые имеют высокий уровень липидов в теле (более, чем 20% сырой массы), например, мойва, сельдь, форель, лосось и т.д.. Современные представления о вкладе отдельных жирных кислот в энергетические нужды организма базируются на исследованиях, проведенных на аквакультуре. При искусственном выращивании рыб (сем. Salmonidae) в условиях северных регионов было показано, что в их теле синтезируются в больших количествах 16:0, 18:1(п-9), 20:1(п-9), 22:1(п-11), а также 20:5(п-3), 22:6(п-3) жирные кислоты использующиеся в основном для энергетических нужд организма, и для роста гонад (Henderson, Almater, 1989; Tocher, 2003). Установлено, что в тканях антарктических рыб, моноеновые жирные кислоты в первую очередь подвергаются окислению по сравнению с длинноцепочечными насыщенными жирными кислотами (Sidell et aL, 1995). В целом можно отметить, что специфика окисления жирных кислот, которые входят в состав ТАГ жировой ткани рыб, сводится к их избирательному использованию, в отдельные периоды жизни, в результате влияния условий окружающей среды. Рыбы запасают жир в мышцах, что наиболее характерно для пелагических видов (анчоусы, мойва, макрель, сельдь) или в печени (треска, палтус). У большинства рыб северного полушария в липидах мышц из насыщенных ЖК преобладают 16:0 и 18:0, из семейства (п-6) ПНЖК - 20:4(п-6), из МНЖК - 18:1(п-9), при этом уровень 20:5(п-3), 22:6(п-3) ЖК варьирует (Tocher, 2003). Так же установлено, что в липидах отдельных видов рыб (сельдь, американская сельдь, мойва) содержится высокий уровень 20:1(п-9) и 22:1(п-11) кислот, которые образуются при окислении 20:1 и 22:1 жирных спиртов восковых эфиров, доминирующих в липидах калянусов, являющихся основным источником питания. У рыб южного полушария установлен довольно низкий уровень МНЖК, особенно 20:1(п-9) и 22:1(п-11) жирных кислот. У рыб северного полушария показатель соотношения 20:5(n-3)/22:6(n-З) был в пределах от 1,0 до 1,5, а у рыб южного полушария - 2,0. Одна из наиболее распространенных теорий, объясняющая высокое содержание (n-З) ПЖНК, в частности, 20:5п-3 и 22:6п-3 жирных кислот в липидах рыб, говорит о корреляции между эффектом ненасыщенности и точкой плавления липидов. Высокий уровень ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов рыб способствует изогнутости клеточных мембран при снижении температуры среды, при этом содержание (n-З) ПНЖК обеспечивает более высокую степень ненасыщенности, чем наличие семейств (п-6) и (п-9) ПНЖК. Рядом исследователей показано, что рыбы холодных вод содержат больше кислот семейства (n-З), которые удовлетворяют их потребность в незаменимых жирных кислотах в большей степени, чем наличие (п-6) и (п-9) жирных кислот, уровень которых больше у рыб из теплых вод (Cejas et al., 2002).
Установлено, что пальмитиновая и докозагексаеновая кислоты являются одними из ключевых в процессе развития лосося и других рыб, и преобладают во фракции фосфатидилхолина (Bell et al., 2001). Пальмитиновой кислоте принадлежит ключевая роль в метаболизме насыщенных жирных кислот у рыб. В организме значительная часть ее элогируется и десатурируется, а докозагексаеновая кислота - это «механизм адаптации» экзотермов, в том числе и рыб (Крепе, 1981). Значительное число пресноводных рыб, включая Salmonidae, могут превращать 18:3(п-3) кислоту в 20:5(п-3) и 22:6(п-3), используя несколько энзиматических процессов десатурации и элонгации, кроме того, они могут из 18:2(п-6) кислоты синтезировать 20:4(п-6) кислоту. В пресной воде молодой лосось использует в пищу большое число беспозвоночных, богатых 18:2(п-6) и 18:3(п-3) кислотами, но с низким содержанием 20:5(п-3) и 22:6(п-3). После миграции лосося в море, рацион питания сменяется на другие виды беспозвоночных, которые богаты 20:5(п-3) и 22:6(п-3) кислотами (Bell et al., 2001).
ЖК являются наиболее вариабельными компонентами липидных молекул, количественный и качественный состав которых тесно связан с трофо-экологическими условиями жизни гидробионтов: видовой спектр питания, доступность кормовых объектов и особенностями температурного, гидрологического режима мест обитания.
Показано, что значительная часть ЖК-остатков липидов рыб поступает непосредственно из пищи и отражает видовой состав кормовых объектов (Robin, 1995; Сущик, 2008). В целом состав ЖК биомассы животных не отличается столь явной таксономической специфичностью, как таковой у бактерий и растений. Наиболее характерными составляющими ракообразных являются 16:0, 18:1(п-9) и ПНЖК 20:5(п-3), 22:6(п-3), 20:4(п-6). Как правило, большой набор ЖК, содержится в ТАГ ракообразных, а в полярных липидах превалируют длинноцепочечные ПНЖК (Сущик, 2008). Водные беспозвоночные составляют основную массу питания морских рыб и поставляют им незаменимые ПНЖК, такие как линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты, а также отдельные МНЖК, которые не могут синтезироваться в организме рыб de novo (Falk-Petersen et al., 2001). Пища, т.е. жирнокислотный состав предыдущих трофических уровней считается основным фактором, определяющим состав ЖК биомассы рыб (Сущик, 2008),. Как морские, так и пресноводные рыбы характеризуются относительно высоким содержанием докозагексаеновой кислоты по отношению к эйкозапентаеновой ( 1). Сравнение липидного статуса морских и пресноводных рыб показало, что в тканях последних содержится относительно больше насыщенных и С18 ПНЖК, а у морских рыб выше содержание С20 и С22 ПНЖК. При этом пресноводные рыбы отличаются от морских более низким соотношением (п-3)/(п-6) ПНЖК (Сущик, 2008). В процессе трансформации вещества, в частности, ПНЖК по пищевым цепям происходит их накопление на более высоких трофических уровнях, к которому относятся рыбы.
Корреляция между температурой и жирнокислотным составом липидов проходит через всю пищевую цепь рыб и выражается в увеличении ненасыщенности липидов при более низких температурах (Cossins, Prosser, 1978; Falk-Petersen et al., 1990; Velansky, Kostetsky, 2008; Сущик, 2008). Жирные кислоты влияют на адаптацию рыб к температурным условиям, за счет изменения вязкости мембран и активности ферментов. Увеличение двойных связей в ПНЖК разрыхляет плотную упаковку молекул в бислое, поэтому с повышением содержания этих кислот в липидах, их удельная плотность уменьшается, а текучесть и проницаемость бислоя возрастает. С изменением текучести меняется температура фазового перехода мембранных липидов, влияющих на активность большинства встроенных в мембрану ферментов - цитохромоксидазы, глюкозо-6 фосфотазы, УДФ-глюкуронилтрансферазы, сукцинатдегигрогеназы, Na,K-ATO азы, Са-АТФ-азы, аденилатциклазы и др. (Лось, 2001).
Район сбора проб - акватория архипелага Свалбард, о. Шпицберген
Количественные соотношения отдельных липидов и жирных кислот у пресноводных и морских рыб подвержены определенным вариациям при действии экологических факторов среды - абиотических (температура, скорость течения, соленость), биотических (спектр питания), а также физиологического состояния организма, в частности, возрастных особенностей, связанных с ростом органов и тканей и рядом других условий (Лапин, Шатуновский, 1981; Гершанович и др., 1991; Rainuzzo et al., 1997). Для гидробионтов высоких широт установлена повышенная степень устойчивости к действию факторов среды, которая может выражаться в смене поведения животного до полной модификации жизненного цикла к суточным и годичным ритмам смены обеспечения светом, температуры воды и как следствие, пищевого режима. Детальные исследования по особенностям биохимических адаптации, в частности, накоплению липидного компонента были проведены различными авторами на видах, которые имеют коммерческое значении (треска, мойва, сельдь). Аналогичных работ, выполненных на рыбах, являющихся промежуточным звеном или консументами первого порядка, к которым относится люмпен пятнистый и другие виды семейства Stichaeidae относительно мало (Ochiai, Fuji, 1980; Falk-Petersen et al, 1984; Miki et al., 1987; Keats et al., 1993; Smith, Wootton, 1999; Rose, 2005; Murzina et al., 2008).
Люмпен пятнистый в процессе своего развития имеет важную особенность, заключающуюся в смене условий обитания: от пелагиали (малек) к бентосу (взрослая особь). Мальки люмпена пятнистого остаются пелагическими до 3 летнего возраста (Ottesen, unpubl.) в результате чего на ранних этапах развития они сталкиваются с влиянием многообразных экологических факторов. Установлено, что уровень ОЛ в мышцах и жировом мешке мальков, выловленных в трех биотопах - Конгсфиорд, Исфиорд, и V10, был относительно высок и составлял: в мышцах - 27,95, 26,24 и 24,48% сухого вещества, соответственно, в липидном мешке - 58,31, 40,55 и 46,41% сухого вещества, соответственно, и не различался, что может свидетельствовать об общей стабильности этого компонента на действие экологических факторов среды. Запасные липиды в теле рыб распределяются не дисперсно, а откладываются в определенных местах - жировых депо (Лапин, Шатуновский, 1981). У мальков люмпена основным депо является липидный или жировой мешок, а часть липидов запасена в мышечной ткани. Проведенный гистологический анализ, показал, что липидный мешок - удлиненное образование прозрачного или желтого цвета, состоящий из «липидных капель» неправильной формы и расположенный на вентральной части тела от плавательных плавников до ануса. Липидное депо этой области гомогенно, в нем не обнаружены жировые клетки — адипоциты. Каждая «липидная капля» неправильной формы. Липидный мешок окружен простой мембраной из соединительной ткани. Несколько липидных капель было обнаружено над кишечником и около основания плавников. Мышечные волокна у мальков были хорошо и плотно упакованы и включали межмышечные липидные запасы, что может свидетельствовать о том, что малыш хорошие пловцы. Жировые депо характеризуются высоким уровнем запасных липидов. Как в мышцах, так и в жировом мешке доминирующую позицию среди ОЛ занимают энергетические липиды, которые представлены группами ТАГ и ВЭф. В жировом мешке ТАГ является единственным запасным энергетическим компонентом, а в мышцах - ТАГ и ВЭф.
Известно, что одним из приспособлений гидробионтов высоких широт к неблагоприятным условиям среды является способность накапливать большое количество запасных липидов, за счет питания высокоэнергетической пищей, в течение короткого арктического лета (Cossins, Prosser, 1978; Lund, Sidell, 1992; Stuart et al., 1998; Аракелова и др., 2004). Летний сезон считается наиболее продуктивным периодом в Арктике, после которого гидробионты могут в течение длительного зимнего периода обходиться без пищи (Weslawski et al., 2006; Moller, 2006). Главным пищевым компонентом для мальков люмпена летнего сезона становятся два вида копепод: Calanus glacialis - типично арктический представитель и Calanus finmarchicus - занесенный в арктические воды с атлантическими течениями. Эти виды накапливают до 70% (сухой массы тела) липидов, из них 60% составляет запасная группа липидов - ВЭф (Scott et al., 2000; 2002). Несмотря на то, что у мальков люмпена основную часть рациона питания составляли эти виды копепод, доля ВЭф в мышцах и липидном мешке у молоди не превышала 2% сухого вещества и не различалась по уровню у рыб из разных биотопов. Известно, что у мальков рыб активность отдельных пищеварительных ферментов может быть очень высокой, что способствует трансформации ВЭф пищи в ТАГ для нужд организма рыбы в сложившихся условиях среды обитания (Tocher, 2003; Pepin, 2003; Olsen, 2004). ТАГ являются запасными быстрообменивающимися липидами у пелагических рыб и имеют тенденцию накапливаться в мышцах и липидном мешке у мальков, как было отмечено и в нашей работе. В то время как ВЭф группа запасных медленнообменивающихся липидов характерна для рыб ведущих донный образ жизни (Sargent, Henderson, 1986; Scott et al., 2002; Kattner et al., 2007). Самый большой уровень ТАГ был установлен в мышцах мальков из открытого и глубоководного биотопа VI0 по сравнению с молодью из двух фиордов - Исфиорд и Конгсфиорд. Этот результат можно объяснить гидрографическими особенностями этого фиорда (V10), который расположен в открытых арктических водах, где происходит смешение теплых атлантических с более холодными арктическими водами в пелагической зоне. При этом, эта акватория разнообразна по качеству и количеству кормовых объектов (Hop et al., 2002; Weslavski et al., 2006; Soreide et al., 2008), что может быть причиной накопления молодью люмпена более высокого содержания ТАГ.
При сравнении спектра ТАГ в мышцах и липидном мешке рыб из двух фиордов - Исфиорд и Конгсфиорд, первый из которых расположен географически южнее второго, показано, что в Исфиорде их уровень выше в мышцах и ниже в липидном мешке, чем таковой у рыб из Конгсфиорда. Возможно, такое различие по количеству ТАГ в мышцах и липидном мешке мальков из этих фиордов связано с разными трофо-экологическими условиями. Известно, что теплые воды атлантического течения в летний сезон имеют разный характер распределения во фиордах: в Конгсфиорде течение оказывает влияние на всю площадь фиорда, а в большем по размерам Исфиорде атлантическое течение затрагивает только поверхностные слои воды на входе в него, в то время как внутренние шельфовые воды находятся под влиянием опресненных ледниковых вод (Hop et al., 2002; Weslavski et al., 2006).
Содержание общих липидов, фосфолипидов, индивидуальных фосфолипидов и жирных кислот в мышцах и жировом мешке мальков люмпена пятнистого из трех биотопов (Исфиорд, Конгсфиорд, V10) северо-западного побережья о. Шпицберген
Оогенез люмпена пятнистого не отличается от других костистых рыб (Jalabert, 2004). У исследованных нами рыб обнаруживаются некоторые особенности в формировании и накоплении липидов в ооцитах самок люмпена, тесно связанные с действием экологических факторов и спецификой репродуктивного цикла. Были исследованы ооциты трех разных сезонов (зима, лето, осень), которые находились на следующих фазах развития: фазе первичного роста ооцитов, фазе вторичного роста ооцитов, вителлогенезе и фазе созревания (Wallace, Selman, 1979; Selman, Wallace, 1983; Kjesbu et al., 1989; Hop et al., 1995) или периодах: превителлогенеза, вителлогенеза и завершения созревания (Мурза, Христофоров, 1991).
Фаза первичного роста включает две стадии развития ооцитов: хроматин ядрышковая и ядрышковая, первая из которых в нашем исследовании не была обнаружена. Можно полагать, что эта стадия развития ооцитов проходит по времени раньше, чем были взяты для анализа исследованные гонады (апрель). В ооцитах на предядрышковой стадии развития (в зимний сезон) формируются мелкие кортикальные вакуоли (альвеолы) по периферии ооплазмы ооцита. Это специфические лизосомальные структуры, которые выполняют ряд важных функций в развивающемся ооците, в том числе в регуляции процессов активности ферментов, необходимых для созревания ооцитов (Мурза. Христофоров, 1991; Shabanipour, Heirdari, 2004).
Ооциты фазы вторичного роста выявлены таюке в гонадах самок в зимний сезон, причем эта фаза развития подразделяется на две стадии — формирования кортикальных вакуолей (альвеол) и формирования липидных капель. Увеличивающиеся в размере и количестве кортикальные альвеолы ооцита на стадии формирования кортикальных вакуолей (альвеол) также необходимы для оптимального функционирования ферментных систем. Кроме того формирование этих структур на ранних стадиях развития, в дальнейшем может играть важную роль при оплодотворении. Установлено, что формирование и последующий выход этих вакуолей в перевителлиновое пространство ооцита препятствует полиспермии во время оплодотворения и дальнейшего формирования эмбриона. Зона-радиата (третья мембрана ооцита), расположенная между текой и гранулозой (две другие мембраны) обнаруживалась с помощью световой микроскопии в ооцитах именно этой стадии развития. Эта мембрана обеспечивает защиту яйца после оплодотворения (Shabanipour, Heidari, 2004). Следующая стадия развития ооцита — формирование липидных капель, также была описана для ооцитов люмпена в зимний сезон. Количество липидных капель, которые в основном представлены группой энергетических липидов, значительно увеличивается, что приводит к формированию плотного «кольца» из липидных капель вокруг ядра ооцита. Мембрана зона-радиата становится толще, а радиальные каналы, которые ее пронизывают, начинают включаться в процесс поступления веществ из крови к ооциту. Кроме того у эмбриона эта мембрана имеет значение после оплодотворения (освобождение от продуктов метаболизма) (Breining, Britz, 2001; Shabanipour, Heidari, 2004).
Фаза развития ооцитов вителлогенез, была выявлена в гонадах самок люмпена пятнистого в летний сезон. Ооциты укрупняются, и во многом их размер зависит от количества формирующихся в них желточных глобул (желток), которые представляют собой комплекс макромолекул (Мурза, Христофоров, 1996). Вителлогенин, синтезируемый клетками печени транспортируется с током крови к ооцитам, а затем проникает по каналам мембраны внутрь клетки. Именно на этой фазе развития в ооцитах начинают накапливаться липидные компоненты, за счет которых возможно дальнейшее успешное развитие эмбриона.
Фаза созревания ооцитов (начало) была обнаружена нами в гонадах самок рыб в осенний сезон. Желточные глобулы формируют гомогенную массу после своего укрупнения и занимают всю центральную часть ооцита. При этом очень важно отметить, что одно крупное или несколько среднего размера липидных капель остаются на анимальном полюсе ооцита. Такие же капли были обнаружены и в яйцах некоторых лососевых (Мурза, Христофоров, 1991; Hop et al., 1995). Безусловна главная функция желтка — это обеспечение энергетическими компонентами развивающегося эмбриона рыбы, а также выклюнувшейся личинки (за счет желточного мешка). Одна из функций липидных капель - это обеспечение фактора плавучести и правильной ориентации яйца при формировании зиготы, что особенно важно в условиях сильных течений (Sandnes, Leive, 1965; Kjesbu et al., 1992). Вероятно, наличие липидных капель один из вариантов адаптации самок люмпена при кладке яиц. Поскольку они откладывают оплодотворенные яйца в кладку на небольших глубинах, но на плотных (каменистых) грунтах чтобы избежать плотного слипания или повреждений оплодотворенных яиц в них сформированы, описанные выше липидные капли. Поэтому общая масса кладки обладает плавучестью. Это также обеспечивает их (оплодотворенные яйца) нормальную аэрацию и вывод продуктов метаболизма в среду.
Данные гистологического анализа сезонной динамики формирования и накопления липидов в ооцитах люмпена в процессе развития подтверждаются биохимическими исследованиями (изменением количества отдельных классов липидов). В процессе созревания гонад самок люмпена пятнистого, в печени также наблюдаются изменения как в количественном, так и в качественном составе липидов. Так, количество и размеры липидных капель гепатоцитов и их накопление в печени (от зимы к осени) совпадает с развитием гонад. При этом количество липидных вакуолей в гепатоцитах возрастало прямо пропорционально и к концу осени эти образования могли занимать более 50% пространства гепатоцита. В зимний период, предположительно, после икрометания, количество липидов значительно уменьшалось, что свидетельствует о больших энергозатратах, и вновь содержание липидов возрастало в течение арктического лета к осени, в период, когда рыбы активно питаются. Снижение уровня ТАГ в печени в зимний период свидетельствует о том, что эта группа энергетических липидов наиболее активно используется для поддержания нужд организма при зимовке: в условиях низких температур и меньшего количества пищевых объектов. Общее количество ТАГ и ВЭф (энергетические липиды) возрастало к осени, что связано с активным питанием самок, обеспечением развития ооцитов и снабжением их необходимыми липидными компонентами к периоду икрометания.
