Введение к работе
Актуальность проблемы. Транспортные АТФазы относятся к основным системам, осуществляющим первично - активный транспорт ионов, формируя на мембране электрохимические градиенты, энергия которых используется для процессов возбуждения нервной и мышечной ткани, транспорта аминокислот, Сахаров и других метаболитов через плазматическую мембрану клетки. Кроме того, поддерживая внутриклеточный и внеклеточный гомеостаз одно- и двухвалентных катионов, эти системы обеспечивают необходимые условия для нормального протекания жизненноважных процессов на уровне клетки и целого организма (Болдырев, Мельгунов, 1985). Несомненно, что чрезвычайно важная роль систем активного транспорта ионов в клеточном метаболизме должна коррелировать с многообразием способов контроля за их активностью как со стороны клетки, так и целого организма.
В отношении транспортных АТФаз, как и для других ферментов существуют два основных способа регуляции их активности: изменение количества молекул фермента в процессе биосинтеза и модуляция активности уже существующей популяции молекул. Биосинтез молекул фермента de novo можно рассматривать как путь долгосрочной или " отсроченной" регуляции; модуляция активности уже имеющихся молекул фермента отражает срочные потребности клетки и получила название краткосрочной регуляции (Bertorello, Katz, 1993).
Безъядерные эритроциты млекопитающих являются высокоспециализированными клетками, которые могут выполнять функцию переноса кислорода к тканям и органам при сохранении внутриклеточного гомеостаза, в том числе, одно- и двухвалентных катионов. Отсутствие ядра лишает эти клетки возможности решать долгосрочные задачи за счет синтеза молекул de novo, что выдвигает на первый план путь краткосрочной регуляции метаболизма клетки в процессе ее функционирования. С этой точки зрения эритроцит является уникальным объектом исследования внутриклеточной регуляции активности ферментов, в том числе, и транспортных АТФаз. Кроме того, отсутствие внутриклеточных мембранных структур позволяет исследователям получать однородные препараты мембран, что значительно упрощает интерпретацию полученных результатов. При исследовании активности и свойств транспортных АТФаз в препаратах мембран эритроцитов и целых клетках возникает одна проблема - изначально низкая активность ферментов в клетках. Однако, несмотря на это обстоятельство, в последнее десятилетие проведен ряд исследований, связанных с поиском в этих клетках внутриклеточных регуляторов транспортных АТФаз. На сегодняшний день в эритроцитах обнаружены как ингибиторы (Yingst, 1988, 1992), так и активаторы (Петруняка и соавт., 1990, 1994) Na,K-АТФазы, а также модуляторы активности Са-АТФазы (Болдырев, Мельгунов, 1985; Орлов,1987; Maudlin, Roufogalis, 1980; Nassi et al., 1990,1991; Liguri et al., 1994; Fifschi et al.,1995). Имеются литературные данные о тесной связи
Ка,К-АТФазы с белковыми компонентами мембранного скелета, в частности, с белком полосы 3 (Fossel, Solomon, 1983; Janoshazi, Solomon, 1989), якорным белком анкирином (Nelson et al.,1987,1991; Morrow et al.,1989; Bennett, 1992), а через мембранный скелет- с гликолитическими ферментами (Proverbio,Hoffman, 1977; Mercer, Dunhum,1981; Low et al.,1993). Кроме того, было показано влияние белков мембранного скелета на активность Na.K-АТФазы (Казенное, 1991; Bertorello et al., 1992; Bertorello, Katz, 1993), а также Са-АТФазы (Казеннов,1991; Baskin,Langdon, 1981).
Анализ литературных данных показал, что в указанных работах решались конкретные задачи, однако, совокупность полученных результатов позволяла предположить, что белки мембранного скелета могут быть посредниками в реализации внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности Ыа,К-АТФазы и Са-АТФазы или непосредственно учавствовать в каталитическом цикле этих ферментов. Для экспериментальной проверки выдвинутого предположения необходимо бьшо выбрать соответствующие методические подходы, а также объекты и методы исследования, которые позволяли бы более адекватно решать соответствующие задачи.
Цель и задачи исследования.
В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось изучение роли белков мембранного скелета эритроцитов млекопитающих в функционировании транспортных АТФаз. Для достижения этой цели мы ставили перед собой следующие задачи :
модифицировать и стандартизовать методы выявления и определения активности транспортных АТФаз в безъядерных эритроцитах млекопитающих и их мембранных препаратах;
в сравнительном плане у разных видов млекопитающих провести сопоставление активности транспортных АТФаз и изучить кинетические свойства ферментов в целых эритроцитах, их тенях и мембранных препаратах, лишенных белков мембранного скелета;
сравнить влияние гемолизата и солюбшшзированных белков мембранного скелега эритроцитов млекопитающих на активность транспортных АТФаз в различных мембранных препаратах, а также модулирующее влияние двухвалентных катионов и АТФ на этот процесс;
изучить особенности влияния на ферменты белков мембранного скелета, солюбилизированных из теней эритроцитов, полученных в присутствии и отсутствие двухвалентных катионов и хелаторов в среде гемолиза и промывающих растворах;
- с помощью гель-фильтрации, провести разделение смеси солюбилизированных белков мембранного скелета на отдельные компоненты, идентифицировать их с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и исследовать влияние отдельных белковых фракций на активность транспортных АТФаз.
Научная новизна.
Показано, что применение твина 20 позволяет выявить активность №,К-АТФазы в эритроцитах млекопитающих без существенного изменения кинетических характеристик фермента. Использование хелатора при получении мембранных препаратов безъядерных эритроцитов на стадии гемолиза позволяет получать стабильную и хорошо воспроизводимую активность Ка,К-АТФазы, которая не зависит от способности препаратов мембран эритроцитов "запечатываться" при помещении их в изотоничную среду инкубации.
В сравнительном плане у нескольких представителей млекопитающих изучена активность транспортных АТФаз в эритроцитах, тенях эритроцитов и препаратах мембран, лишенных белков мембранного скелета. Обнаружены различия в активности транспортных АТФаз в эритроцитах и их мембранных препаратах у исследованных животных, а также снижение активности ферментов после удаления внутриклеточного содержимого в процессе получения теней эритроцитов и после солюбилизации белков мембранного скелета из теней эритроцитов.
Исследование кинетических характеристик АТФазной и фосфатазной стадий ферментативного цикла ИаД-АТФазы показало, что удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов крысы сопровождается изменением чувствительности фермента к модификаторам реакционного цикла (двухвалентные и одновалентные катионы, АТФ, рН среды инкубации). На основании проведенного исследования предложена гипотетическая схема участия белков мембранного скелета в реакционном цикле Na.K-АТФазы.
Впервые продемонстрировано разнонаправленное, зависимое от концентрации двухвалентных катионов, влияние гемолизата на АТФазную и фосфатазную активности Ыа,К-АТФазы в тенях эритроцитов крысы и в препаратах мембран, лишенных основных белков мембранного скелета.
Впервые проведено сравнительное изучение активности транспортных АТФаз в тенях эритроцитов крысы, полученных с использованием различных сред гемолиза эритроцитов и промывающих растворов. Показано, что смесь солюбилизированных белков мембранного скелета из разных препаратов мембран обладает как ингибирующим, так и активирующим эффектом на активность транспортных АТФаз из различных источников. Выраженность этого эффекта определяется наличием и соотношением двухвалентных катионов магния и кальция в среде определения ферментативной активности.
Проведено разделение с помощью гель-фильтрации солюбилизированных с мембранных препаратов теней эритроцитов крысы белков мембранного скелета. Впервые показано, что отдельные фракции солюбилизированных белков мембранного скелета эритроцитов обладают модулирующим влиянием на активность транспортных АТФаз, зависящим от наличия двухвалентных катионов в среде инкубации, а также интактности цитоскелета препаратов мембран.
Научно-практическая значимость работы.
На основании изучения активирующего действия мембранотропных агентов (твина 20 и ЭДТА) на Na.K-АТФазу эритроцитов млекошітающих предложены адекватные и хорошо воспроизводимые методы определения активности транспортных АТФаз в эритроцитах и их мембранных препаратах.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о роли белков мембранного цитоскелета в функционировании транспортных АТФаз, в том числе, в восприятии и трансформации внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцию активности ферментов. Результаты исследования расширяют теоретические представления о роли цитоскелета мембран эритроцитов как посредника в регуляции активности мембраносвязанных ферментов, что важно для понимания механизмов внутриклеточного контроля как ионного, так и осмотического статуса клетки.
Результаты проведенного исследования используются при чтении общих курсов лекций по биохимии и биофизике и специального курса "Биологические мембраны и транспорт ионов" студентам Тюменского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Использование твина 20 и хелаторов в оптимальных концентрациях позволяет выявлять хородю воспроизводимую активность транспортных АТФаз в эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов млекопитающих, без существенного изменения кинетических характеристик ферментов.
-
Удаление внутриклеточного содержимого эритроцитов в процессе получения теней эритроцитов приводит к снижению активности транспортных АТФаз в препаратах мембран по сравнению с целыми клетками человека, крысы, мыши, морской свинки, но не хомячка и кролика, что свидельствует о наличии в эритроцитах млекопитающих внутриклеточных модуляторов ферментов. На это указывают и результаты экспериментов по предварительной инкубации теней эритроцитов млекопитающих с гемоли-затом, в которых показано активирующего влияние внутриклеточного содержимого эритроцитов на транспортные АТФазы из различных источников.
-
Удаление белков мембранного скелета из теней эритроцитов сопровождается изменением активности и чувствительности Na,K-АТФазы к модификаторам реакционного цикла фермента, в частности, к АТФ, рН среды инкубации, одно- и двухвалентным катионам.
4. Прединкубация препаратов мембран из различных источников со
смесью солюбилюированных белков мембранного скелета вызывает по
вышение активности транспортных АТФаз; при этом, эффект активации
зависит от наличия в среде определения ферментативной активности двух-
валентных катионов мапіия и кальция, а также от ннтактностн структуры цитоскелета препаратов мембран.
-
Разделение смеси солюбилизированных белков мембранного скелета с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 показало наличие в получаемых белковых фракциях Са2+- и Mg2+ -зависимых факторов, обладающих разпопаправлеными модулирующими эффектами в отношении транспортных АТФаз из различных источников.
-
Белки мембранного скелета эритроцитов выполняют функцию адаптера внутриклеточных сигналов, направленных на регуляцшо активности транспортных АТФаз, и, кроме того, могут быть непосредственны вовлечены в реакционный цикл исследуемых ферментов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на : 6-ой конференции биохимиков Прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига, 1981), Областной межвузовской конференции молодых ученых и специалистов (Тюмень, 1985), Межуниверситетской Всесоюзной конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), 1-ой Всесоюзной конференции "Биохимия -медицине" (Ленинград, 1988), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, 1989), Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1991), 4-ом Симпозиуме по биохимии липидов (С-Петербург, 1995), 23-ей конференции федеращш Европейских биохимических обществ (Basel, 1995), 1-ом конгрессе федерации Европейских физиологических обществ (Maastricht, the Netherlands, 1995), 1-ом (11) Международном совещании по эволюционной физиологии (С-Петербург, 1996).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов исследований, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает ЗЇ9 источников, в том числе 3/3 на иностранных языках. Работа изложена на Л7І страницах машинописного текста, иллюстрирована S3 рисунками и / таблицами.
