Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Роль NEDD9 в регуляции онкогенной молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников Габбасов Рашид Тагирович

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Габбасов Рашид Тагирович. Роль NEDD9 в регуляции онкогенной молекулярной сигнализации в эпителиальных опухолях яичников: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.01.04 / Габбасов Рашид Тагирович;[Место защиты: «Казанский (Приволжский) федеральный университет].- Казань, 2016.- 120 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 13

1.1. Эпителиальный рак яичников: общие сведения 13

1.1.1. Клинические особенности ЭРЯ 13

1.1.2. Классификации злокачественных эпителиальных опухолей яичников: связь с концепциями этиологии и патогенеза ЭРЯ

1.2. Влияние иммунного микроокружения на развитие ЭРЯ 16

1.3. Молекулярные механизмы развития ЭРЯ

1.3.1. Участие белков фокальных контактов в развитии ЭРЯ 17

1.3.2. ЭРЯ и регуляция апоптоза: PI3K/AKT/mTOR каскад 20

1.3.3. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: ERBB2-RAS-MAPK сигнальный путь 21

1.3.4. ЭРЯ и регуляция клеточного деления: Aurora-киназы 22

1.3.5. ЭРЯ, межклеточные контакты и эпителиально-мезенхимальный переход 24

1.3.6. STAT3: участие в воспалительных процессах и метастазировании ЭРЯ 26

1.4. NEDD9 как участник молекулярной сигнализации злокачественных

новообразований 27

1.4.1. История открытия и названия NEDD9 28

1.4.2. Строение белка NEDD9 29

1.4.3. Участие NEDD9 в молекулярной сигнализации и развитии злокачественных патологий 1.4.3.1. Регуляция экспрессии NEDD9 30

1.4.3.2. NEDD9 как регулятор работы фокальных контактов и мишеней их сигнализации 32 1.4.3.3. NEDD9 как регулятор Aurora A киназы 34

1.4.3.4. NEDD9 и эпителиально-мезенхимальный переход 35

1.4.3.5. Участие NEDD9 в передвижении и злокачественных патологиях клеток системы иммунитета 36

1.4.3.6. NEDD9 и рак яичников 37

Экспериментальная часть 38

Глава 2. Материалы и методы исследований 38

2.1. Реактивы и оборудование 38

2.1.1. Реактивы 38

2.1.2. Оборудование 41

2.2. Объекты исследований 43

2.2.1. In vivo мышиные модели ЭРЯ 43

2.2.1.1. Мыши, нокаутные по Nedd9 43

2.2.1.2. Мышиная модель спонтанного ЭРЯ 44

2.2.1.3. Сингенетическая мышиная модель ЭРЯ 45

2.2.2. Клеточные линии 45

2.3. Исследование влияния экспрессии NEDD9 на развитие спонтанного ЭРЯ in vivo 47

2.3.1. In vivo магнитно-резонансная томография 47

2.3.2. Исследование инфильтрации иммунныx клеток в мышах при помощи проточной цитометрии 48

2.4. In vitro эксперименты на культурах клеток ЭРЯ человека и мыши 50

2.4.1. Исследование клеточной пролиферации 50

2.4.2. Исследование клеточной адгезии 50

2.4.3. Клеточная миграция и инвазия в градиенте ФБС 51

2.4.4. Исследование клеточной миграции на двумерной поверхности 52

2.4.5. Нокдаун гена NEDD9 в клетках ЭРЯ мыши и человека 52

2.4.6. Нокдаун генов STAT3, Fak и Src в клетках MOVCAR 5009 и

иммунофлюоресцентный анализ 55

2.5. Сравнение влияния внутриопухолевой экспрессии NEDD9 на развитие ЭРЯ в с таковым в микроокружении опухоли 56

2.6. Исследование общей генной экспрессии в спонтанных опухолях мышей MISIIRAg 59

2.7. Иммунологические методы

2.7.1. Вестерн-блоттинг 60

2.7.2. Коиммунопреципитация 61

2.7.3. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток 62

2.8. Статистический анализ 62

ГЛАВА 3. Результаты исследований 63

3.1. Роль NEDD9 в развитии спонтанного ЭРЯ 63

3.1.1. Влияние делеции Nedd9 на развитие спонтанных опухолей яичников 63

3.1.2. Влияние делеции Nedd9 на молекулярную сигнализацию в опухолях MISIIRAg мышей 63

3.2. Влияние NEDD9, экспрессируемого в микроокружении опухоли, на

развитие ЭРЯ 67

3.2.1. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на развитие опухолей яичников 67

3.2.2. Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на молекулярную сигнализацию в опухолях яичников 69

3.2.3. Влияние делеции Nedd9 на инфильтративность клеток системы иммунитета 70

3.3. Влияние экспрессии NEDD9 в клетках первычных опухолей на развитие эпителиального рака яичников 72

3.3.1. Влияние делеции Nedd9 на агрессивность клеток ЭРЯ in vitro 72

3.3.2. Подтверждение in vitro наблюдений при помощи нокдауна Nedd9 в Nedd9+/+ клетках ЭРЯ 75

3.3.3. Влияние внутриклеточной делеции Nedd9 на агрессивность ЭРЯ in vivo 77

3.3.4. Влияние делеции Nedd9 в первичных опухолях на молекулярную сигнализацию 78

3.4. Роль NEDD9 в регуляции активации и локализации STAT3 в клетках ЭРЯ 82

3.4.1. Регуляция активации и локализации STAT3 в фокальных контактах клеток ЭРЯ 82

3.4.2. Исследование образования комплекса между pSTAT3Y705, NEDD9 и pFAKY397.. 83

3.5. NEDD9 как регулятор генной экспрессии в контексте ЭРЯ 84

3.5.1. Влияние делеции Nedd9 на генную экспрессию в опухолях MISIIRАg мышей. 84

3.5.2. Участие NEDD9 в экспрессии генов, регулируемых FOXJ1 92

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 95

Выводы 103

Список литературы

Влияние иммунного микроокружения на развитие ЭРЯ

Другая группа мишеней сигналов, идущих от ФК - компоненты сигнальной оси ERBB2-RAS-MAPK.

Мембранная рецепторная тирозиновая протеинкиназа (РТК) ERBB2, называемая также HER2/neu, является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR). ERBB2 стоит во главе многих важных сигнальных путей, таких как упомянутый выше PI3K-путь, или митоген-активируемый протеинкиназный (MAPK) каскад. Экспрессия ERBB2 повышена в 9-30% ЭРЯ (Lee-Jones, 2004). RAS – семейство низкомолекулярных гуанин-трифосфатаз, участвующих во многих сигнал-трансдуцирующих каскадах. В частности, RAS служит посредником между EGFR и участниками MAPK-каскада. Многократно показано участие белков RAS в злокачественном перерождении, инвазии и метастазировании различных видов рака (Leitao and Barakat, 2009).

Митоген-активируемый протеинкиназный (mitogen-activated protein kinase, MAPK) каскад является важным сигнал-трансдуцирующим сигнальным путём, передающим стимулы от разнообразных рецепторов обширному ряду нижерасположенных мишеней. МАРК протеинкиназы – сборная группа белков, включающая три небольших семейства протеинкиназ: p38, JNK/SAPK (c-JunNerminal kinase/Stress activated protein kinase) и ERK (Exracellular signal regulated kinase) (Потехина и Надеждина, 2001). Все МАРК протеинкиназы в неактивном состоянии находятся на мембране, но после активации перемещаются в ядро (Cargnello and Roux, 2011).

Каждое из семейств MAPK состоит из трёх последовательно включающихся в работу киназ: собственно MAPK, MAPK-киназа (MAPKK) и MAPKK-киназа (MAPKKK). MAPKKK взаимодействует с белками семейства RAS, и, после активации, передаёт сигнал нижерасположенным мишеням. Киназа p38 участвует в имунном и воспалительном ответах, клеточной пролиферации и подавляет апоптоз. В свою очередь, JNK, и в особенности ERK известны как регуляторы клеточной пролиферации (Cargnello and Roux, 2011).

Родственные серин-триониновые киназы ERK1 и ERK2 (гомология кодирующей последовательности составляет 85%, в следствие чего эти белки зачастую рассматриваются совместно) необходимы для быстрого прохождения клетки из G1 в S фазу (Cargnello and Roux, 2011). ERK1/2 активируются в ответ на фосфорилирование в Tyr204/187, и трионине Thr 202/185, причём для киназной активности ERK1/2 необходимо фосфорилирование как по тирозину, так и по треонину (Roskoski, 2012). MAPK-каскад конститутивно активен в 70-80% пограничных и низкодифференциированных, и примерно в 40% высокодифференциированных серозных ОЯ. Предположительно, в низко- и высокодифференциированных ОЯ работают разные механизмы активации механизмы MAPK-каскада (Hsu et al., 2004).

Семейство серин-триониновых киназ Аurora состоит из трёх белков: Aurora kinase A (AURKA), Aurora kinase B (AURKB), и Aurora kinаse C (AURKC). Все три Aurora-киназы являются незаменимыми участниками процесса клеточного деления (Do et al., 2013). Нарушения в экспрессии и активности киназ Aurora, приводят к генетической нестабильности, анэуплоидии и клеточной смерти.

В контексте настоящей работы наиболее интересной представляется AURKA. Данная киназа координирует работу клеточного центра, сборку веретена деления и расхождение хромосом. Кроме того, AURKA участвует в регуляции так называемой точки проверки сборки веретена деления и перехода от фазы G2 к фазе M (Goldenson and Crispino, 2014). Ингибирование AURKA приводит к остановке клеточного цикла на G2/M переходе и апоптозу (Gautschi et al., 2008). Гиперэкспрессия AURKA, связанная с амплификацией и/или транскрипционной активацией гена AURKA, обнаружена во многих опухолях, в том числе и в ЭОЯ (Do et al., 2013). AURKA непосредственно фосфорилирует p53, контролируя стабильность и активность последнего. Гиперекспрессия AURKA приводит к деградации р53 через MDM2 и таким образом может быть связана с сигнализацией AKT (Katayama et al., 2004).

AURKВ способствует конденсации хромосом во время митоза, участвует в проверке веретена деления, а также является необходмым участником процесса цитокинеза: в отсутствие экспрессии или киназной активности AURKВ, дочерние клетки остаются соединёнными между собой (Ohi et al., 2004, Lan et al., 2004).

AURKС является наименее изученным представителем семейства Aurora-киназ. В норме AURKС экспрессируется в гонадах; отсутствие экспрессии AURKС ведёт к нарушению мейоза I и образованию больших полиплоидных ооцитов у мышей (Lan et al., 2004).

Повышенная экспрессия всех трёх Aurora-киназ часто наблюдается в различных опухолях, включая ЭОЯ (Goldenson and Crispino, 2014).

Значительную роль в развитии злокачественных заболеваний играет эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) - явление комплексного репрограммирования биохимии клетки, приводящее к приобретению эпителиальными клетками, в норме поляризованными, мезенхиального фенотипа, который характеризуется повышенной клеточной миграцией и инвазией, а также способностью к выживанию в неадгезированном состоянии (Sulzmaier et al., 2014). Центральное явление при ЭМП – это так называемое переключение кадгеринов, когда уровень Е-кадгерина понижается, а экспресия N-кадгерина, напротив, повышается (Liliac et al., 2012).

Кадгерины – суперсемейство Ca2+-зависимых трансмембранных гликопротеинов, необходимые для межклеточной адгезии и узнавания. Семейство включает в себя E-(epithelial, эпителиальный), N- (neural, нейрональный), P- (placental, плацентарный), и VE-(vascular endothelial, сосудистого эндотелия) кадгерины, названные в соответствии с тканями, где они были впервые обнаружены (El-Masri etal., 2009). Кадгерины соединяются с цитоскелетом посредством белков катенинов, в частности -катенина. Пониженная экспрессия Е-кадгерина ведёт к высвобождению -катенина, перемещению его от мембраны в цитоплазму и участию в транскрипции некоторых онкогенов, в том числе генов c-myc и циклина D1 (Tian et al., 2011).

Клетки агрессивных карцином часто теряют межклеточные связи вследствие нарушений в синтезе Е-кадгерина и диссоциации кадгерин-катениновых комплексов. Потеря межклеточных связей может привести к повышенной миграции и пролиферации малигнизирующихся клеток, и, в дальнейшем, к ЭМП. Причинами нарушений в синтезе Е-кадгерина могут служить мутации и транскрипционный сайленсинг гена CDH1, а также гиперметилирование его промотора вследствие неправильной экспресии регуляторных факторов (El-Masri etal., 2009). Таким образом, для многих карцином характерна пониженная относительно нормального эпителия экспрессия Е-кадгерина.

Регуляция экспрессии NEDD9

Для изучения влияния экспрессии NEDD9 на развитие спонтанных опухолей ЭРЯ были использованы мыши линии MISIIRAg-DR26, скрещённые с мышами, нокаутными по Nedd9. Трансгенная линия мышей MISIIRAg была получена Connolly и сотрудниками в 2003 году (Connolly et al., 2003) на основе линии C57BL/6. MISIIRAg животные экспрессируют протоонкогены - большой и малый T-антигены (TAg) обезъяньего вируса SV40 под контролем промотора рецептора антимюллерова гормона II типа (Mllerian inhibiting substance type II receptor, MISIIR). Как показали Connolly и коллеги, экспрессия MISIIR у мышей высока в клетках поверхностного эпителия яичников. Соответственно, у самок MISIIRAg-мышей онкогены TAg экспрессировались преимущественно в ПЭЯ, что приводило к образованию билатеральных спонтанных опухолей яичника. По гистопатологическим и генетическим особенностям образующиеся мышиные опухоли были сходны с высокодифференциированными серозными карциномами яичников человека (Connolly et al., 2003). Как и ЭРЯ человека, данные опухоли часто метастазировали в брюшную полость и сопровождались асцитами. Спустя несколько лет после первого сообщения о MISIIRAg мышах, той же группой были выведены мыши MISIIRAg-DR26, развивающие ОЯ с пенентрантностью 100% к четвёртому месяцу жизни (Hensley et al., 2007). По характеру генетических изменений, опухоли MISIIRAg мышей можно отнести к опухолям II типа по классификации Kurman и Shih (Shih Ie and Kurman, 2004; см. раздел 1.1.2).

Для получения MISIIRAg-Nedd9-/- мышей, MISIIRAg-DR26 животных скрещивали с Nedd9-/- мышами, по следующей схеме (TAg = MISIIRAg-DR26; отбиравшийся для последующего скрещивания генотип подчёркнут): 1. P: Nedd9-f- x STAg+/+ Fl: TA2+/-:Nedd9+/ 2. P: Nedd9-f- x TAz+/-;Nedd9+/ Fl: TAg+/-;Nedd9+/ TAg/-;Nedd9+/Ag/-;Nedd9/A2+/-:Nedd9-f 3. P: ZNedd?- 8lAg Nedd9± Fl: TAt ;Nedd9-A TAS+/-:Nedd9-/-Для экспериментов отбирали MISIIRAg+/-;Nedd9+/+ (в качестве контроля) и MISIIRAg Nedd - мышей.

В 2010 году Quinn и коллеги охарактеризовали мышиную линию MSIIRAg-low, производную линии MISIIRAg. Животные MSIIRAg-low экспрессируют гены TAg на относительно низком уровне, вследствие чего не развивают спонтанных опухолей, в отличие от MISIIRAg мышей (Quinn et al, 2010). Была показана возможность использования MISIIRAg-low мышей как иммунокомпетентных реципиентов для ортотопической имплантации клеток MOVCAR, о которых рассказано ниже. Таким образом, мыши MISIIRAg-low использовались для создания сингенетической мышиной модели ЭРЯ. Мышей MISIIRAg-low- edd - получали по схеме, аналогичной описанной в подразделе 2.2.1.2.

Культуры клеток мыши и человека инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37С. Для клеток мыши использовали ростовую среду DMEM с добавлением 4% ФБС, 1x ITS, 2 мМ L-глутамина и пенициллин 46 стрептомицина (100 ед./мл и 100 мкг/мл, соответственно). Клеточные линии человека инкубировали в ростовой среде RPMI-1640 с добавлением 10% ФБС, 1x ITS, 2 мМ L-глутамина и пенициллин-стрептомицина (100 ед./мл и 100 мкг/мл, соответственно). В некоторых экспериментах использовали среды DMEM и RPMI-1640 без добавок. Для снятия адгезированных клеток со дна флаконов, монослой промывали PBS и заливали раствором трипсин-ЭДТА на 2-5 минут.

Nedd9+/+ и Neddtf- клетки MOVCAR (от англ. mouse ovarian carcinoma -карцинома яичников мыши) были ранее выделены из асцитов мышей MISIIRAg с соответствующими генотипами (Connolly et al., 2003). В экспериментах использовали следующие клеточные линии MOVCAR (названы по номерам мышей, из которых были изолированы): Nedd9+/+ линии MOVCAR 6111, 5009, 8248, 8250, и Neddtf линии MOVCAR 136, 143, 145, 168.

Кроме того, в данной работе использовали клеточные линии ЭРЯ человека: A1847 и NIH:OVCAR5, приобретённые в отделе культур тканей Онкологического центра Фокс Чейз.

Оценку жизнеспособности и подсчет плотности клеток производили на гемоцитометре после окраски клеток 0,4%-ным раствором трипанового синего. Расчёт виталитета клеток (V) производили по формуле: V = (а-Ь) 100% / а, где a - общее количество клеток b - количество синих (нежизнеспособных) клеток В экспериментах использовали суспензии с количеством жизнеспособных клеток не менее 90%.

Исследование влияния экспрессии NEDD9 на развитие спонтанного ЭРЯ in vivo

Итак, нами было показано, что экспрессия NEDD9 в микроокружении опухоли не играет значительной роли на рост и распространении ЭРЯ. Для исследования роли внутренней экспрессии NEDD9 в опухолевых клетках на развитие и молекулярную сигнализацию в ОЯ, провели серию in vitro экспериментов на группах Nedd9+/+ (MOVCAR 6111, 5009, 8248, 8250) и Nedd9-/- (MOVCAR 136, 143, 145, 168) клеточных линий, выделенных ранее из MISIIRAg мышей соответствующего генотипа.

Одна из первых описанных функций NEDD9 – это участие в интегриновой сигнализации и, как следствие, в клеточной адгезии. Анализировали адгезию MOVCAR клеток к фибронектину и коллагену I типа, компонентов ВКМ. Эксперименты не выявили различий между Nedd9+/+ и Nedd9-/- линиями MOVCAR в адгезии к этим субстратам (рис. 13, Рисунок 13. Слева: анализ адгезии клеток MOVCAR к фибронектину. На гистограмме приведены данные для индивидуальных клеток (обозначены соответствующими номерами), и средние для данного генотипа (обозначены как Nedd9+/+ и Nedd9-/-). Справа: анализ пролиферации клеток MOVCAR, приведены средние значения для линий данного генотипа. слева; данные адгезии к коллагену не приведены; здесь и далее тёмным цветом обозначены Nedd9+/+, светлым – Nedd9-/- клеточные линии). NEDD9 также часто упоминается как фактор, способствующий клеточной пролиферации. Пролиферацию оценивали при помощи колориметрического реагента CyQuant (Thermo). Анализ не выявил различий, связанных с Nedd9-генотипом, в пролиферации клеток MOVCAR (рис. 13, справа).

Хемотаксис играет важную роль в метастатическом распространении злокачественных опухолей. Хемотактическую миграцию MOVCAR-клеток в градиенте ФБС измеряли на системе xCELLigence. Эксперименты выявили повышенный хемотаксис Nedd9+/+-клеток при наличии градиента ФБС (рис. 14, слева; индекс миграции - отношение значений миграции в градиенте ФБС к таковому в отутствие градиента). В то же время, было замечено, что в контрольных лунках без градиента ФБС Nedd9-/--клетки в среднем более мигративны, чем Nedd9+/+-клетки (не показано).

Далее, также на системе xCELLigence, провели анализ инвазивности MOVCAR клеток в слое Матригеля. Достоверных различий в инвазивности между клетками разных генотипов обнаружено не было (рис. 14, справа). Однако, как и при анализе миграции, была замечена повышенная инвазивность Nedd9-/- клеток в отсутствие градиента ФБС (не показано).

Неожиданное наблюдение ускоренного перехода Nedd9-/- клеток MOVCAR из верхнего цилиндра камеры Бойдена в нижнюю в условиях отсутствия градиента хемоаттрактанта могло указывать на повышенную спонтанную мигративность Nedd9-/--клеток in vitro. Для поддтверждения этого наблюдения, дополнительно провели анализ миграции клеток в монослое при моделировании раны, отражающий способноость клеток к коллективной миграции, которая наблюдается in vivo в обширном ряде карцином (Крахмаль и др., 2015). На приведённом на примере микрофотографии отчётливо видно, что «рана» на монослое Nedd9-/- клеток за 12 часов эксперимента сомкнулась сильнее, чем у контрольных клеток (рис. 15). Рисунок 15. Коллективная миграция клеток MOVCAR при моделировании раны. Слева: примеры микрофотографий, клетки линий MOVCAR Nedd9+/+ 8250 и Nedd9-/- 136. Лидирующий фронт монослоя отмечен пунктиром. Справа: данные количественного анализа для индивидуальных клеточных линий и средние для всех клеток данного генотипа (в правой части гистограммы).

Для доказательства того, что наблюдавшиеся в Nedd9-/- MOVCAR клетках эффекты вызваны именно делецией Nedd9, провели эксперименты с нокдауном гена NEDD9 в культурах клеток ЭРЯ человека (A1847 и NIH:OVCAR5) и мыши (MOVCAR 6111 и 5009). Для каждой клеточной Рисунок 16. Проверка нокдауна гена NEDD9 в клеточных линиях ЭРЯ мыши (сверху) и человека (снизу). «-» и «+»- клетки, трансдуцированные, соответственно, контрольными векторами, не содержащими кшРНК, и содержащим кшРНК к GFP. 1, 2, А, Б – клетки, трансдуцированные различными кшРНК к гену NEDD9. линии использовали две независимые кшРНК, специфичные к гену NEDD9, а также две контрольные кшРНК. Эффективность нокдауна на белковом уровне определяли методом Вестерн-блот (рис. 16).

Далее проанализировали эффект нарушения экспрессии NEDD9 на адгезию клеток к фибронектину и коллагену I типа и миграцию в монослое при моделировании раны. Нарушение экспрессии NEDD9 не привело к значимым изменениям адгезивности клеточных линий ЭРЯ человека и мыши (не показано). В то же время выявлено статистически достоверное повышение коллективной миграции всех проанализированных клеток при нарушении экспрессии NEDD9 (рис. 17).

Было проведено четыре независимых эксперимента, в каждом из которых использовались разные пары Nedd9+/+ и Nedd9-/- клеточных линий MOVCAR. Изначально каждая клеточная линия была имлантирована в 10 мышей. До окончания эксперимента выжили 35 мышей с Nedd9+/+ и 34 мыши с Nedd9-/- имлантами. Как показано на рис. 18, две из имплантированных клеточных линий (8250 и 145), не вызвали образования опухолей спустя продолжительное время после имплантации (соответственно, 24 и 23 недели). Мыши, в которых были имплантированы клетки MOVCAR 8250 145 были исключены из последующего анализа. Оставшиеся аллографты разных генотипов на момент эвтаназии в среднем имели опухоли равных объемов.

Делеция Nedd9 имела значительный отрицательный эффект на развитие первичных опухолей в MISIIRAg-low мышах. Во-первых, Nedd9-/-аллографты в среднем росли значительно медленнее контрольных (102 ± 7 дня для Nedd9-/- против 74 ± 4 дней для Nedd9+/+ опухолей; рис. 19А).

Влияние делеции Nedd9 в микроокружении опухоли на молекулярную сигнализацию в опухолях яичников

В настоящей работе впервые показано, что NEDD9 регулирует активацию транскрипционного фактора STAT3 в ОЯ in vivo (рис. 8) и локализацию активированной формы STAT3 (pSTAT3Y705) в фокальных контактах клеток карциномы яичников (рис. 21). Кроме экспрессии NEDD9, для локализации STAT3 в ФК была необходима экспрессия активной формы киназы FAK, но не Src (рис. 21), причём pSTAT3Y705 формировал комплекс с NEDD9 и pFAKY397 (рис. 22). По всей видимости, NEDD9 выполняет скаффолдинговые функции в процессе фосфорилирования STAT3 киназой FAK в фокальных контактах клеток ЭРЯ. Эти результаты дополняют полученные нами ранее данные о положительной роли STAT3 в мигративности и адгезивности клеток ЭРЯ in vitro, а также в перитонеальном распространении ЭРЯ в мышах (Gritsina et al., 2015).

Как было указано в разделе 1.3.2, AKT1 принимает участие в целом ряде про-онкогенных процессов, в том числе препятствует апоптозу и способствует мигративности клеток ЭРЯ. Наши данные показывают, что NEDD9 способствует повышению киназной активности AKT1 в ОЯ (рис. 8 и 20). Учитывая то, что активация митогенной киназы ERK в ОЯ не зависела от экспрессии NEDD9, можно предположить, что замедленние роста Nedd9-/-спонтанных опухолей и аллографтов (рис. 7A и 19A) - с одной стороны -связано связано с понижением активности AKT1; напомним, что AKT1 препятствует апоптозу, опосредованно приводя к деградации супрессоров опухолей p53 и p73 (Basu, 2003). С другой стороны, NEDD9 положительно регулировал общую экспрессию митотической киназы Aurora A в спонтанных опухолях яичников и аллографтах (рис. 8 и 20), что указывает на возможную роль NEDD9 в регуляции роста эпителиальных опухолей яичников. Отметим, что нами не получено данных об участии NEDD9 в активации Aurora A киназы in vivo по причине отсутствия в продаже антител, специфических к фосфорилированным формам Aurora A мыши. Судя по данным экспрессии E- и N-кадгеринов, а также транскрипционного регулятора TWIST1, NEDD9 не способстует ЭМП в опухолях яичников in vivo. Напротив, как в спонтанных опухолях, так и в аллографтах, наблюдалось положительное влияние NEDD9 на экспрессию E-кадгерина. Казалось бы, это противоречит данным, полученным на культурах клеток и мышиной модели рака молочной железы (см. раздел 1.4.3.4). Объяснить повышение экспрессии E-кадгерина в опухолях мышей MISIIRAg и Nedd9+/+ аллографтах мышей MISIIRAg-low можно следующим образом. Как упоминалось в разделе 1.3.5, в норме E-кадгерин не экспрессируется в поверхностном эпителии яичников. В процессе малигнизации клетки ПЭЯ сначала повышают экспрессию E-кадгерина, а затем теряют её, после чего могут отслаиваться и метастазировать. По всей видимости, причиной повышения экспрессии E-кадгерина в Nedd9+/+ ОЯ (рис. 8 и 20) стала не положительная регуляция со стороны NEDD9, а бльшая степень злокачественности этих опухолей, о чём говорят и перечисленные выше данные о повышение активации FAK, Src, STAT3 и AKT.

Вне контекста опухоли NEDD9 также положительно влияет на злокачественность клеток ЭРЯ. В частности, нами показано, что клетки MOVCAR, экспрессирующие NEDD9, проявляли больший хемотаксис in vitro (рис. 14, слева). В то же время, делеция Nedd9 достоверно повышала спонтанную мигративность клеток MOVCAR in vitro (рис. 15). Поcледнее явление можно было объяснить тем, что делеция Nedd9 способствовала селекции более агрессивных клеток в мышах MISIIRAg. Подобное было ранее описано в мышах, развивающих спонтанный РМЖ (Singh et al., 2010; см. разд. 1.4.3.2). В нашем случае данной гипотезе противоречили следующие результаты. Во-первых, как было отмечено, делеция Nedd9 привела к уменьшению хемотаксиса в клетках MOVCAR in vitro. Во-вторых, нарушение экспрессии NEDD9 при помощи кшРНК в Nedd9+/+ MOVCAR-клетках и клетках ЭРЯ человека привело к тому же эффекту, что и в Nedd9-/ клетках MOVCAR (рис. 17). В-третьих, при возврате в опухолевую среду (имплантации в мышей MISIIRAg-low), Nedd9+/+ клетки развивались в более агрессивные опухоли по сравнению с Nedd9-/- аллографтами (рис. 19Б).

Из последнего наблюдения следует второе возможное объяснение повышенной мигративности Nedd9-/- клеток MOVCAR in vitro: эффект внутриклеточной экспрессии NEDD9 на агрессивность клеток ЭРЯ зависит от условий их роста и не проявляется в двумерной культуре. В литературе имеются данные, поддерживающие данное предположение. Так, ранее было показано, что Nedd9-/- мышиные эмбриональные фибробласты мигрировали быстрее контроля в условиях двумерного роста, и медленнее – в условиях роста в трёхмерном матриксе (Zhong et al., 2012). Оказалось, что NEDD9 стабилизирует фокальные адгезии. В отсутствие же экспрессии NEDD9 ФК обладают большей динамичностью, что приводит к повышенной мигративности Nedd9-/- клеток в двумерной системе (Zhong et al., 2012).

Таким образом, можно предположить, что внутриклеточная экспрессия NEDD9 может способствовать развитию ЭРЯ через повышение хемотаксиса клеток данной карциномы. При этом, влияние NEDD9 на фенотипические характеристики клеток ЭРЯ происходит через регуляцию онкогенной молекулярной сигнализации, которая в свою очередь зависит от условий роста клеток. Способность NEDD9 индуцировать онкогенную сигнализацию в клетках ЭРЯ проявляется в контексте опухоли. Кроме того, побочно была подчёркнута важность подтверждения in vitro данных в животных моделях, так как проявление отрицательных свойств потенциально онкогенным белком, в данном случае NEDD9, может зависеть от условий роста раковых клеток. Разрабатывающиеся сегодня in vitro системы, позволяющие симулировать рост клеток в опухоли, могут в будущем повысить достоверность данных, полученных на культурах клеток (Schreiter et al., 2012, Edmondson et al., 2014, Ravi et al., 2015).