Содержание к диссертации
СОКРАЩЕНИЯ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
I. Локализация и количественное содержание
ДНК в клетках высших растений 7
Ядерная ДНК 7
Митохондриальная ДНК 13
Хлоропластная ДНК .... .17
П. Характеристика разных классов последовательностей яДНК и организация генома
высших растений 23
Уникальные последовательности 23
Обращенные повторы 31
Повторяющиеся последовательности 33
Ш. СтДНК высших растений 36
Распространение .36
Свойства 40
Локализация и возможные функции 44
ЭКСПЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования 46
Выделение ядер 46
Выделение яДНК 47
Выделение суммарной ДНК 48
Очистка ДНК 48
Выделение ДНК Micrococus lysodeikticus 48
Определение концентрации ДНК по Бартону 49
Фрагментация молекул ДНК. 49
Аналитическое равновесное ультрацентрифугирование в градиенте плотности CsCi 49
10. Аналитическое равновесное ультрацентри^у-
гирование в градиенте плотности актино-
мицин D-GaCl 50
11. Аналитическое равновесное ультрацентрифу
гирование в градиенте плотности iig++-Cs?soA..... 50
12. Препаративное ультрацентрифугирование
в градиенте плотности CsCi 51
13. Препаративное ультрацентрифугирование
в градиенте плотности Hg++-cs2so4 52
Хроматография ДНК на колонке МАК 52
Тепловая денатурация препаратов ДНК 52
Изучение кинетики реассоциации 54
Рестрикционный анализ ДНК эндонуклеа-
зой рестрикции Варі 54
Расчеты состава оснований 55
Расчеты содержания пгс 55
Реактивы 56
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. О гетерогенности яДНК цитрусовых растений 57
П. Выделение стДНК цитрусовых растений в
чистом виде 61
Ш. Определение количественного содержания
стДНК в геноме цитрусовых растений 76
ІУ. Физико-химические свойства компонентов
ДНК трех видов цитрусовых растений 79
Дифференциальные кривые плавления 79
Кинетика реассоциации 86
Распределение стДНК цитрусовых растений
в градиенте плотности актиномицин D-OsGi 90
4. Рестрикционный анализ стДНК цитрусовых
растений 92
ВЫВОДЫ 97
ЛИТЕРАТУРА 98
СОКРАЩЕНИЯ:
яДНК - ядерная ДНК
хпДЖ - хлоропластная ДНК
мтДНК - митохондриальная ДНК
стДНК - сателлитная ДНК
рДНК - рибосомная ДНК
рРНК - рибосомная РНК
йРНК - информационная РНК
тРНК - транспортная РНК
т5с - 5-метилцитозин
Тдд - температура плавления - значение температуры, при
которой увеличение поглощения УФ-света достигает
половины максимальной величины I х SSC - 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0 Ds-Wa - додецилсульфат натрия п.н. - пара нуклеотидов
С - содерлсание ДНК в гаплоидном наборе хромосом, пг. CQt - произведение концентрации ДНК и времени инкубации,
моль нуклеотидов литр -Чсек.
Введение к работе
Ядерная ДНК эукариот состоит из уникальных и повторяющихся последовательностей. Сателлитные ДНК представляют собой частный случай многократно повторяющихся последовательностей. В них повторы ковалентно связаны друг с другом. Эти молекулы удается отделить от основной массы яДНК разными способами градиентного ультрацентрифугирования. Количество стДНК в геноме эукариот варьирует в широких пределах. Несмотря на детальное знание химической структуры и хромосомной локализации стДНК целого ряда организмов, их функциональная роль остается неясной.
Геном эукариот является сложной системой и каждое звено этой системы играет определенную роль в структурной организации и функционировании системы в целом. Знание структуры и функции всех без исключения звеньев этой системы, в том числе и стДНК и возможных механизмов взаимодействия между ними,позволит в конечном счете построить истинную картину структурной и функциональной организации генома эукариот.
Целью настоящей работы являлось выявление наличия стДНК у цитрусовых растений и исследование их физико-химических свойств. В связи с этим в задачу исследования входило:
исследование характера распределения яДНК ряда представителей семейства Rutaceae в градиенте плотности CaCi;
определение количественного содержания стДНК в геноме разных видов цитрусовых растений;
выделение стДНК цитрусовых растений в чистом виде;
исследования тонкой структуры кривых плавления, кинетики реассоциации и распределения в градиенте плотности актиномицин D-CsCL стДНК цитрусовых растений;
- проведение рестрикционного анализа стДНК цитрусовых растений.
В результате проведенной работы методом равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCi изучены ядерные ДНК 15 видов семейства Rutaceae. Показано, что отдельные виды различаются по количественному содержанию стДНК с плавучей плотностью 1,712 г»см~3. Впервые показано, что вид Poncirus trifoii-ata содержит два сателлитных компонента с плавучей плотностью 1,712 и 1,715 г»см"3. Выделены в чистом виде стДНК трех видов цитрусовых растений. Методом высокоразрешающей термической денатурации получены кривые плавления основных и сателлитных компонентов ДНК изученных видов. На основании значений плавучей плотности и Тдд рассчитано количественное содержание минорного основания m с и показано, что оно преимущественно локализовано в сателлитном компоненте ДНК, Методами кинетики реассоциации и ультрацентрифугирования в градиенте плотности актиномицин D-CsCi показано, что стДНК содержат повторы разной длины и характеризуются межмолекулярной гетерогенностью. Проведен рестрикционный анализ стДНК цитрусовых растений эндонуклеазой рестрикции Вярі.
Полученные данные могут быть непосредственно использованы в селеіщии цитрусовых растений. Открытая нами стДНК с плотностью 1,715 Г«СМ~3 у вида Poncirus trifoliate, который ИСПОЛЬЗуетСЯ в качестве подвоя, а также в селекции новых сортов цитрусовых растений, может быть использована в качестве маркера при оценке гибридных растений. Обнаруженные нами межвидовые различия в характере плавления стДНК хозяйственно ценных видов могут быть с успехом использованы в селекции цитрусовых при оценке гибридных видов и установлении их геномного состава.
