Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Изучение молекулярных механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки клеток в настоящее время прочно утвердилось как одно из основных направлений в современной экспериментальной биологии.
Успехи в решении названной проблемы во многом сдерживаются отсутствием униг реальной модели, позволяющей воспроизводить те или иные ситуации, -имеющие место in vivo.
Удобной моделью для анализа закономерностей пролиферации клеток и координированных изменений активности генов в течение дифференцировки являются развивающиеся эмбрионы позвоночных.
Осоый интерес представляет изучение влияния на указанные . процессы таких важных регуляторов как полипептидные факторы роста (ПФР), которые запасаясь еще в оогенезе [Thery ,et al., 1989], вовлекаются в контроль развития клеток в составе эмбриона уже на стадии первых делений.- Способность эмбриональных клеток к стадие- и тканеспецифическому синтезу собственных ПФР [Slack et al., 1989, Akhurst et al., 1989] сближают их с клетками злокачественных новообразований, что еще более повышает значимость исследования молекулярных механизмов регуляции клеточных делений на начальных стадиях эмбрионального развития животных.
Контроль многоступенчатых процессов, обеспечивающих мито-генный ответ на воздействие ПФР, осуществляется за счет стимуляции ряда тесно сопряженных систем преобразования и передачи регуляторного сигнала внутрь клетки.- В результате исследований последних лет стало ясно, что метаболическую основу усиления и внутриклеточного преобразования сигнала составляют каскадные процессы фосфорилирования-дефосфорилироьания клеточных белков [Никольский и соавт., 1987, James et al., 1984].,
Для клеток ранних эмбрионов Позвоночных данный аспект проблемы к настоящему времени является практически неизученным как на уровне определения роли конкретного ПФР в раннем эмбриогенезе, так и характеристики сигнальных процессов, опосредующих эффекты ПФР на пролиферацию и дифференцировку. клеток-мишеней.
' ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ Ц&шью настоящей работы явилось изучение роли каскадных процессов фзсфоршгарования-дефосфорилирования белков в . сигнальных механизмах', опосредующих действие ЭФР в клетках зародышей костистой рыбы вьюна (Misgrurnus fossil is), изолированных на" стадий ранней гаструлы.
В связи с этим;, в работе были поставлены следующие задачи: \
1.. Выявить способность клеток зародышей вьюна на стадии
- г -
ранней аструлы специфически связывать ЭФР и охарактеризовать кинетические параметры лиганд-рецепторного взаимодействия.
-
Установить функциональность рецепторов ЭФР.
-
Исследовать возможность вовлечения ЭФР в регуляцию про-лиферативной активности эмбриональных клеток.
-
Изучить влияние ЭФР на фосфорилирование белков клеток зародышей вьюна.
-
Частично очистить, охарактеризовать свойства и механизмы регуляции ферментативной активности ЭФР-стимулируемой проте-инкиназы ри-осомного белка S6.;
' б. Исследовать возможный механизм сопряжения рецепторов ЭФР с активацией S6 киназа Экспериментально проверить предположение о рецептор-зависимой транслокации из плазматической мембраны в цитозо.*ь зародышевых клеток фосфотирозин-содержашего белка(-ов), принимающего участие в регуляции активности S6 киназы.
. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЕ В представленной работе впервые на стада^ ранней гаструлы удалось не только выявить, но и охарактеризовать рецепторы ЭФР. . До последнего времени клетками, экспрессирующими рецепторы ЭФР на ранних стадиях эмбрионального развития, считались трофобласты - клетки внеэмбриональной ткани 5-дневных бластоцист мыши [Adamdon et al., 19841. Установлено, что выявленные рецепторы являются- функциональными и способны преобразовывать сигнал о взаимодействии с лигандом в активацию кас . ..здных процессов фосфорилирования-дефосфорилированил внутриклеточных белков. Принципиально важным является вывод о вовлечении ЭФР-подобных белков в регуляцию митотической активности эмбриональных .клеток уже на ранних, этапах развития, .характеризующихся первыми индукционными событиями.
Впервые частично очищена и охарактеризована-митоген-стимулируемая S6 киназа из развивающихся эмбрионов позвоночных класса рыб. Показано сходство фермента с аналогичными белками представителей других классов позвоночных животных.
Впервые для исследования механизмов регуляции активности митоген-стимулируемой S6 киназы была предложена и использована реконструированная система, включающая .отдельные'компоненты цепи переноса регуляторного сигнала. На'основаниг 'проведенных экспериментов сделан вывод о том,'что ЭФР стимулирует транслокацию из плазматической мембраны в цитозоль фосфотирбзин-сбдеркздего бел-ка', вовлекаемого в регуляцию активности'Зб кйназьі.""'
"^'ЧН^-ПГЛКГИ'КОКАЯ-ЭНЛЧИМОСТЬ'- РАБОТЫ.'- -Полученные данные
- Э -
дополняет и расширяет наши представления о закономерностях регуляции деления клеток на ранних этапе эмбрионального развития животных. Наряду с данными литературы их можно рассматривать как основу для более глубокого анализа аутокринной регуляции роста злокачественных новообразований, что открывает пути для рационального поиска онкотерапевтических. средств направленного действия.
Предложенная реконструированная система и схема опыта могут быть использованы при проведении экспериментов in vitro по изучению молекулярных механизмов трансдукции регуляторних сигналов.
АПР^АЦЙЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на VII Всесоюзном совещании по эмбриологии (г. Ленинград, 1985), на V Украинском биохимическом съезде (г. Ивано-Франковск, 1S87), IV Всесоюзном съезде эндокринологов (г. Львов, 1987), Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффек-торные клетки" (г. Суздаль, 1988), Шхдународном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии С г. Таллин, 1988), Всесоюзном совещании по актуальным вопросам клеточной биологии (г. Ленинград, 1989), Іевдународном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (г. Львов, 1990), Советско-финском симпозиуме по биологии развития (г. Суздаль, 1991), конференциях и семинарах во Львовском отделении Института биохимии АН Украина
ПУБЛИКАЦИИ. Пэ материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. ' Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обеуадения, списка использованных сокращений, выводов и списка цитируемой литературы. ,