Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ I. Обзор литературы 15
Введение 15
Глава I. Морфология ядерного матрикса соматических клеток 19
1.1. Немембранные компоненты ядерной оболочки, входящие в состав ядерного матрикса 19
1.2. Интерхроматиновые фибриллярно-гранулярные компоненты ядерного матрикса 21
1.3. Остатки ядрышка, ;:Входящие в состав ядерного матрикса. 23
1.4. Гранулярные структуры ядерного матрикса 25
1.5. Влияние метода изоляции на структуры ядерного матрикса 27
1.6. Заключение 30
Глава 2. Химический и ферментный состав ядерного матрикса 32
2.1. Введение 32
2.2. Химический состав ядерного матрикса 32
2.3. Белки ядерного матрикса, изолированного
из разных клеток и тканей 34
2.3.1. Полипептиды "ламины" или триплета ядерного матрикса 37
2.3.2. Тиоловые группы белков ядерного матрикса. 40
2.3.3. Металлопротеиды ядерного матрикса 44
2.3.4. Фосформирование белков ядерного матрикса 45
2.4. Ферментный состав ядерного матрикса 47
2.5. Заключение... 50
Глава 3. Биологическая роль ядерного матрикса 51
3.1. Введение 51
3.2. К вопросу о биогенезе белков ядерного матрикса 51
3.3. Ассоциация ядерного матрикса с ДНК 58
3.3.1. Краткая историческая справка 58
3.3.2. Ассоциация ново-реплицированной ДНК с ядерным матриксом 62
3.3.3. Фракция ДНК, сохраняющаяся в составе ядерного матрикса 63
3.3.4. Белковый компонент комплекса ДНК-белок ядерного матрикса 66
3.4. Ассоциация ядерных рибонуклеопротеидов
с ядерным матриксом 72
3.4.1. Ассоциация с ядерным матриксом ДНК-подобной РНК 74
3.4.2. К вопросу об ассоциации рибосомных РНК с ядерным матриксом 77
3.4.3. Заключение 79
3.5. Ассоциация стероидных гормонов с ядерным матриксом 79
3.6. Ядерно-цитоплазматический транспорт и его связь со скелетными структурами ядра.... 80
3.7. Заключение 86
Глава 4. Ядерный матрикс гамет 87
Глава 5. Скелетные структуры хромосом 89
Глава 6. Скелетные структуры ядра в течение митоза и клеточного цикла 92
Глава 7. Дцерный матрикс при опухолевом росте 95
Глава 8. Ядерный матрикс при вирусной инфекции клеток.. 97
Общее заключение по литературному обзору 99
РАЗДЕЛ II. Экспериментальная часть 101
Глава 9. Материал и методы исследования 101
9 Л. Материал исследований 101
9.2. Метод выделения ядер из клеток печени крысы 102
9.3. Изоляция ядер из опухолевых клеток 103
9.4. Изоляция ядер из клеток культуры фиброблас-тов китайского хомячка. 104
9.5. Контроль чистоты и морфологической сохранности изолированных ядер 105
9.5.1. Световая микроскопия 105
9.5.2. Электронная микроскопия 105
9.5.3. Отношение РНК/ДНК в препарате ядер...105
9.6. Метод изоляции ядерного матрикса 106
9.7. Фракционирование ядерного матрикса 107
9.8. Изоляция ядерной оболочки .....108
9.9. Получение ядерных белковых фракций 108
9.10. Электрофорез белков ядерного матрикса в поли акриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия 109
9.11. Инкубация клеток с мечеными аминокислотами НО
9.12. Инкубация клеток с мечеными аминокислотами в присутствии антибиотиков 112
9.13. Определение радиоактивности в жидкостном сцинтилляторе III
9.14. Определение радиоактивности на фильтровальных бумажках 112
9.15. Определение радиоактивности во фракциях геля после электрофоретического разделения белков 112
9.16. Определение концентрации белка 113
9.17. Элюирование белка из полиакриламидного геля ИЗ
9.18. Иммунологические методы исследования 114
9.18.1. Получение антигенов и иммунизация...114
9.18.2. Преципитация по Приру 115
9.18.3. Титрование антител. 115
9.18.4. Анализ антител двойной радиальной иммунодиффузией по Ухтерлони 116
9.18.5. Электроиммунный анализ по Лореллу...117
9.18.6. Электрофоретический Перенос белков с полиакриламидного геля на нитро-целлюлозную мембрану с последующей окраской их антителами 117
9.18.7. Непрямая иммунофлуоресцентная микроскопия 118
9.18.8. Иммунопероксидазная окраска 119
9.18.9. Дополнительная обработка клеток при непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии
9.19. Определение транспорта белка, меченого Ни-фенилаланином, из ядра в бесклеточной системе 120
9.20. Техника электронномикроскопического исследования 122
9.20.1. Метод ультратонких срезов.... 122
9.20.2. Метод негативного контрастирования..122
9.20.3. Метод сканирующей электронной микроскопии .122
9.20.4. Метод з амораживания-травления 123
9.21. Список реактивов, использованных в работе..123
Глава 10. Морфология изолированного ядерного матрикса..125
Глава 11. Фракционирование ядерного матрикса 134
Глава 12. Химический состав ядерного матрикса печени крысы 142
12Л. Химический состав ядерного матрикса 142
12.2. Белковый состав четырех фракций ядерного матрикса 150
Глава 13. Иммунологическая характеристика белков ядерного матрикса печени крысы 156
13.I. Иммунологический анализ белков-антигенов ядерного матрикса 157
13.2. Исследование локализации антигенов непрямой иммунофлуоресцентной микроскопией с антителами к щелоченерастворимым белкам ядерного матрикса печени крысы 164
13.3. Влияние химических реагентов на локализацию антигенов ядерного матрикса 170
13.4. Локализация антигенов ядерного матрикса в митотической клетке ....175
Глава 14. Ядерный матрикс регенерирующей печени крысы..180
Глава 15. Ядерный матрикс опухолевых клеток 184
15.1. Введение. 184
15.2. Особенности белкового состава ядерного матрикса опухолевых клеток 185
15.3. Фракционирование ядерного матрикса опухолевых клеток 195
Глава 16. Биогенез белков ядерного матрикса ...200
16.1. Введение. 200
16.2. Включение меченых аминокислот тотальным белком ядерного матрикса и его фракциями...201
16.3. Включение меченых аминокислот электрофо-ретическими фракциями ядерного матрикса....205
16.4. Влияние ингибиторов белкового синтеза на включение меченых аминокислот в белки ядерного матрикса. 209
16.5. Заключение 221
Глава 17. Биогенез поровых комплексов 225
17.1. Введение. 225
17.2. Изменение плотности поровых комплексов на поверхности ядра 225
17.3. Автономность поровых комплексов от мембран ядерной оболочки 228
17.4. Разнообразие поровых комплексов, наблюдаемое на поверхности ядерного матрикса
и интактного ядра 232
17.5. Биохимические и иммунологические данные исследования поровых комплексов 240
17.6. Заключение. 243
Глава 18. Обсуждение 247
18.1. Введение 247
18.2. Исследование структурных компонентов ядерного матрикса. 248
18.2.1. Морфологические исследования ядерного матрикса различных клеток и тканей 248
18.2.2. Биогенез поровых комплексов 252
18.2.3. Иммуноцитохимические исследования фракции фиброзного слоя и ассоциированных с ним поровых комплексов....259
18.3. Белковый состав ядерного матрикса различных клеток и тканей 260
18.3.1. Белки ядерного матрикса печени крысы и его фракций..... 260
18.3.2. Белковый состав ядерного матрикса в клетках с различной метаболической и пролиферативной активностью.270
18.3.3. Биогенез белков ядерного матрикса...275
18.3.3.1. Включение меченых аминокислот в тотальные
белки ядерного матрикса...276
18.3.3.2. Распределение меченых аминокислот между белками ядерного матрикса, разделенными электрофорезом..278
18.3.3.3. Влияние ингибиторов белкового синтеза на включение меченых аминокислот в полипептиды ядерного матрикса 280
18.4. Белки ядерного матрикса в митотической клетке 284
Выводы 287
Список литературы 293
- Немембранные компоненты ядерной оболочки, входящие в состав ядерного матрикса
- Химический состав ядерного матрикса
- К вопросу о биогенезе белков ядерного матрикса
- Ядерный матрикс гамет
- Скелетные структуры хромосом
Введение к работе
Экстракция ядер детергентами, нуклеазами, солевыми растворами низкой и высокой ионной силы позволяет получить остаточные структуры ядра, которые могут различаться в зависимости от используемых реагентов и от последовательности их действия.
В наиболее ранних работах по фракционированию клеточного ядра были использованы концентрированные растворы хлористого натрия и разведенная щелочь (Збарский, Дебов, 1948, 1951; Збарский, 1950; Збарский, Георгиев, 1959а; Георгиев и др., I960; Георгиев, Ченцов, I960; zbarsky, Georgiev,
19596; Збарский I96I6; Mirsky, Ris, 1951; Allfrey et el.,
1955; Steele, Busch#l964). Последовательной экстракцией изолированных ядер 0,14 М NaCI, I - 2 М NaCI и 0,01-0,05 н NaOH были получены и идентифицированы электронной микроскопией глобулиновая фракция (соответствует ядерному соку), дезоксирибонуклеопротеидная фракция (материал ДНП-хроматина) и фракции кислого (материал ядрышек и остаточных хромосом) и остаточного белка. Нерастворимый в щелочи остаточный белок связывали с компонентами ядерной оболочки (Соудек, Бе-неш, 1955; Soudek» Necas, 1963; Георгиев.и др., I960; Zbaraky, aeargiev, 19596; Zbarsky et al., 1962; Збарский, Георгиев 1962; Збарский и др., 1962, 1963). В составе фракции кислого белка описана рибонуклеопротеидная сеть (Збарский, Георгиев, 1962; Georgiev, Chenteon, 1962; Smetana et al»# 1963; Steele, Busch, 1963, 1964,1966 JShankar Nara* yaa et al., 1967; Busch, Smetana, 1970), которая Простирается от ядрышка до ядерной оболочки и обеспечивает ассоциацию рибонуклеиновой кислоты с остатками ядрышка.
В работах лаборатории Збарского было показано, что содержание белковых фракций остаточных структур ядра изменяется при опухолевом росте (Дебов, 1951; Саидов, 1955; Збар-ский, 1961а; Збарский, Дебов, 1955). В ядрах клеток злокачественной опухоли содержание фракций кислого и особенно остаточного белка значительно выше, чем в нормальных клетках (Збарский, Дебов, 1955) и по мере роста трансплантированных солидных опухолей количественное содержание фракции остаточного белка нарастает (Саидов, 1955). Остаточный белок опухолевой клетки, в отличие от такой же фракции из ядер нормальной ткани, содержит сравнительно высокий процент триптофана (Збарский, Дебов, 1951, 1955; Збарский, 1961а) и, помимо характерного для нормальных клеток фибриллярного материала, в его составе описан ламелярный, аморфный материал, характерный ТОЛЬКО ДЛЯ ОПуХОЛеВОЙ КЛеТКИ ( Zbarsky et ai„# 1962; Збарский и др., 1962, 1963).
В настоящее время при получении остаточных структур ядра используют, кроме солевых растворов и щелочи, нуклеазы и неионные детергенты (тритон Х-100, нонидет Р 40 и др.). В ряде лабораторий, применяя перечисленные реагенты в различных сочетаниях и разной последовательности, получены скелетные структуры ядра, обычно называемые ядерным белковым мат-риксом или ядерным матриксом.
Структуры ядерного матрикса, по-видимому, не являются артефактом. В клеточном ядре реально существует скелет или каркас, который, выполняя роль остова, обеспечивает геометрию ядра. В пользу реального существования ядерного скелета свидетельствуют данные Гош с соавторами (Ghosh et «і., 1978), которые наблюдали структуры ядерного матрикса in situ в ядрах клеток Hela и кенгуровой крысы, инкубированных в присутствии *Л-аманитина, вызывающего специфическое сокращение и сегрегацию хроматина от структур ядерного матрикса. Херлан с соавторами (Herian et el», 1978) показали, что в составе изолированного ядерного матрикса сохраняются остаточные компоненты гигантских ядрышек, которые появляются В макронуклеусах Tetrahymena ПОСЛЄ ДЄЙСТВИЯ актиномицина d . Сохранение в матриксе изменений ядра in situ авторы рассматривают как доказательство реального существования этой структуры. Таким образом наличие в ядрах и ядрышках скелетного остова достаточно обосновано.
Ядерный матрикс изолирован из самых различных клеток и
Тканей: ИЗ Печени КрЫСЫ (Berezney, Coffey, 1974а,б), ре-генерирующей печени крысы (Berezney et ai.t 19796), из печени и семенников мышей (Comings, Qkada, 1976а,б), из ткани легкого (Hemminki, 1977; Agutter, Birchall, 1979), из эритроцитов птиц (Cochran et ai„, 1975), из макронуклеусов Tetrahymena ( Herian,Wunderlich, 1976; Wolfe, 1980), из клеток Hela (alley et ai., 1975; Keller, Hiley, 1976; Hodge et al.# 1977; Cohbs, Shelton, 1978; Ghosh et ai.# 1978; Eekeien, Venrooi^ 1981), асцитной гепа-ТОМЫ Зайделя (Berezney,Hughes, 19776; Berezney et al., 1979a), культуры клеток китайского хомячка (Hiidebrand et al», 1975), культуры клеток мышиных фибробластов ЗТБ (Buckler-white et ai.f 1980), клеток кенгуровой крысы P-ME1 ( ahosh et el., 1978), клеток эндометрия животных ( Barrack, Coffey» 1980; Agutter, Birchall, 1979)f кдеток эритролейкемии Фрейд ( bong et ai.j 1979)t личинок Dro-sophila meianogaster ( Piaher et «і.» 1982). Обнаружение ядерного матрикса в таких функционально различных клетках и тканях свидетельствует о его широком распространении, дает основание считать, что ядерный матрикс является универсальной структурой клеток эукариот.
Изоляция ядерного матрикса позволила пересмотреть сложившееся ранее представление о строении ядра. Если раньше считали, что сфера ядра обеспечивается только ядерной оболочкой, то после изоляции скелетного остова ядра или ядерного матрикса стало очевидно, что морфология ядра в значительной степени обусловлена этой структурой. Помимо механической роли каркаса ядерный матрикс, по-видимому, выполняет ряд важнейших функций ядерно-цитоплазматического транспорта, инициации репликации ДНК, транскрипции и транспорта РНК.
Немембранные компоненты ядерной оболочки, входящие в состав ядерного матрикса
Ядерная оболочка рассматривается в настоящее время как сложная структура, в которой различают наружную и внутреннюю мембраны, ограничивающие перинуклеарное пространство, и немембранные компоненты - фиброзный слой, прилегающий к внутренней мембране и обеспечивающий связь ее с внутриядерными структурами, и поровые комплексы, ассоциированные с фиброзным слоем ( Franke, Scheer, 1971; Kartenbeck et al.t 1971; Збарский, 1972; Zbarsky, 1978). В ядрах, обработанных тритоном Х-100, мембранные компоненты ядерной оболочки отсутствуют, но фиброзный слой и ассоциированные с ним по рОВЫв КОМПЛеКСЫ СОХранЯЮТСЯ ( Barton et al„, 1971; Aaron son, Blobel, 1975; Bwyer, Blobe2,I976; Kirschner et «i», 1977). Отсюда следует, что поверхность ядерного матрикса, изолированного из ядер обработанных детергентом,представлена немембранными компонентами ядерной оболочки - фиброзным слоем и поровши комплексами.
На ультратонких срезах ядерного матрикса видно, что фиброзный слой окружает матрикс непрерывным электронноплотным слоем толщиной 10-30 НМ ( Berezney, Coffey, 1977; Berezney,
1979а). В препарате ядерного матрикса, растянутом на капле воды, видна фибриллярная основа фиброзного слоя (coming», Qkada, 1976а). С тонкофибриллярной сетью фиброзного слоя ассоциированы поровые комплексы, сохраняющие структуру типичную для порового комплекса интактного ядра: диаметр порового комплекса около 80-100 нм, хорошо видна аннулярная структура, видны фибриллы, соединяющие гранулы порового комплекса между собой (Comings, Okada, 1976а). Высказывается предположение, что фиброзный слой обеспечивает биогенез поровых комплексов
( Kirschner et al., 1977; Maul, 19776) И, ПО-ВИДИМОМу, Определяет распределение ИХ На ПОВерХНОСТИ ЯДра ( Maul et al., 1971; Maui, 1977a и б; Markovics et ai„ 1974). Белки фиброзного слоя и поровых комплексов устойчивы в концентрированных растворах хлористого натрия, в присутствии детергентов и нуклеаз, что объединяет их с белками ультраструктурных компонентов ядра, выделяемых в составе ядерного матрикса.
Последовательной обработкой изолированных ядер печени крысы ДНКазой I, тритоном Х-100 и I М NaCI, т.е. реагентами используемыми обычно при получении препарата ядерного матрикса, в лаборатории Блобела получена относительно чистая фракция фибрОЗНОГО СЛОЯ И ПОрОВЫХ КОМПЛеКСОВ ( Aaronson, Blobel, 1975; Dwyer, віоЬеі, 1976). Электрофорез белков этой фракции в SDS - полиакриламидном геле выявил три преобладающих полипептида с молекулярной массой 60-70 Щ. Авторы предполагают, что полипептиды 60-70 Щ входят в состав фибриллярной ОСНОВЫ фиброзного СЛОЯ ( Gerace et а!., 1978; Aaronson, Coruzzi, 1979, Gerace, Blobel, 1980). ЭТО Предположение подтверждается данными, что антитела к названным полипептидам окрашивают исключительно периферию ядра ( Krohne et ai., 19786; Ely et al., 1978; Gerace, Blobel,1978) (подробнее см.ниже).
Химический состав ядерного матрикса
В настоящей главе приведены основные данные по химическому составу ядерного матрикса печени крыс и других клеток. Большая часть этих данных была получена на протяжении последних 7-8 лет параллельно с нашими исследованиями.
Кроме химического состава ядерного матрикса в этой главе представлены имеющиеся сведения о ферментативной активности препарата ядерного матрикса. Сведений о ферментах скелетных структур ядра сравнительно мало и нам казалось целесообразным не выделять эти вопросы в отдельную главу.
2.2. Химический состав ядерного матрикса
Ядерный матрикс различных клеток и тканей характеризуется близкими структурными компонентами и, как свидетельствуют данные приведенные в таблице 2Л, достаточно близким химическим составом.
Основным химическим компонентом ядерного матрикса являются негистоновые белки, на долю которых приходится по данным разных авторов от 72 до 98% состава препарата. В препарате ядерного матрикса содержится I-2& рибонуклеиновых кислот, показано наличие высокомолекулярной, гетерогенной ядерной РНК, низкомолекулярных ядрышковых РНК (см.гл.3,4).
К вопросу о биогенезе белков ядерного матрикса
Выделение скелетного остова ядра поставило перед исследователями задачу выяснить возможное участие ядерного матрикса в метаболических процессах клетки. Поскольку в ядре заложена генетическая информация, возникает, прежде всего, вопрос о роли ядерного матрикса в организации и функции хроматина в интерфазных клетках и метафазных хромосомах, об участии ядерного матрикса в транскрипции и транспорте ри-бонуклеопротеидов. Выяснению этих вопросов посвящены исследования ряда лабораторий и за последние 4-5 лет достигнуты существенные результаты, опубликованные в обзорных работах (Comings, 1978; Berezney, 1979а; Agutter, Hichardson, 1980; Georgiev et al., 1981).
К вопросу о биогенезе белков ядерного матрикса
До настоящего времени мы не располагаем данными о биогенезе белков ядерного матрикса. Неизвестно, в каких именно клеточных структурах осуществляется их синтез - в цитоплазме с последующим быстрым транспортом в ядро или, наоборот, в ядре. Можно предположить также, что предшественники или часть белков ядерного матрикса синтезируются в цитоплазме, другая часть - в ядре. Однако биосинтез белков ядерного матрикса в ядре возможен лишь при условии, что в ядрах есть собственная белоксинтезирующая система, но и этот вопрос остается дискуссионным. Существует мнение, согласно которому все ядерные белки синтезируются в цитоплазме, поскольку из ядер не удается выделить полноценные, функционирующие рибосомы (Snerrer, ISarcaud, 1968; Penman, 1966; Warner, 1971; Wu,Warner, 1971).
Вместе с тем все больше накапливается данных демонстрирующих собственную белоксинтезирующую систему в ядрах различных клеток и тканей (Aiifrey et U, 1955, 1957; 1964; Allfrey, Mirsky, I958;Rendi, I960; Rees, Rowland, 1961; Re«s et i,, 1962; Гвоздев, Пономарева-Степная, 1963; Uete, 1967; Никольский и др., 1970; Heimsing, 1970, 1971; Anderson et !,, 1972; Кульминская и др., 1974; Блохина, Романцев, 1966; Блохина и др., 1971; Блохина, Коржова,1976; Матинян, Уманский 1978; & iiwitz, Mueller, 1969 и многие другие). Автономный синтез ядерного белка наблюдали по скорости включения меченых аминокислот в изолированные ядра. Показано активное включение меченых аминокислот в белки ядер обработанных детергентами, солюбилизирующими мембранные структуры и очищающими, таким образом,фракцию ядер от рибосом, СВЯЗанНЫХ С наружной Мембраной ядерной обоЛОЧКИ (Anderson et ai.# 1972; Кульминская и др., 1974; Матинян, Уманский, 1978). Включение аминокислот в ядерные белки наблюдали после экстрагирования рибосом хлористым магнием и дезоксихолатом натрия ( tei# Wang, 1965; Гвоздев, Пономарева-Степная, 1963).
Перечисленные работы свидетельствуют в пользу предположения, что в ядрах есть собственная белоксинтезирующая система и наряду с тем, что часть белков ядра, например, гистоны, синтезируется исключительно в цитоплазме, возможен ядерный синтез, обеспечивающий новообразование ряда белков ядра, в том числе, возможно, и белков ядерного матрикса. Однако механизм синтеза полипептидов в этой системе изучен еще слабо, много противоречивых и не ясных положений.
Ядерный матрикс гамет
Своеобразная форма ядерного матрикса показана в поздних ооцитах Rana temporeria (Збарский, Филатова, 1979; barsky, 1981; Филатова и др., 1982). В поздних ооцитах фибриллярные ядрышки и микроядрышки, синаптонемальные комплексы и псевдомембраны с многочисленными поровыми комплексами группируются в кариосферу. После обработки изолированной кариосферы нуклеазами, концентрированным раствором хлористого натрия и разведенной щелочью происходит деградация ее структур и отчетливо выявляются скелетные структуры, соответствующие ядерному матриксу соматических клеток.
После обработки ДНКазой в фибриллярных ядрышках кариосферы видна сетчатая структура, которая своей периодичностью напоминает периодичность синаптонемальных поликомплексов и, таким образом, может указывать на родство или связь последних с матриксом ядрышек и микроядрышек (Филатова и др., 1982). Эти наблюдения согласуются с данными Камингса и Окада (comings, Okada, 1976а; comings, 1978), которые наблюдали синаптонемальные поликомплексы в составе ядерного матрикса, изолированного из пахитенных мышиных клеток при интенсивной обработке их ДНКазой и РНКазой.
Электрофорез изолированной кариосферы выявляет около 20 полипептидов, из которых три компонента соответствуют белковому триплету, характерному для матрикса соматических клеток. Однако в отличие от последнего кариосфера обогащена высокомолекулярными полипептидами с молекулярной массой от 130 до 200 КД. Таким образом, в кариосфере ооцита и ядерном матриксе соматических клеток наблюдаются не только сходные ультраструктурные компоненты, но и химические составные части их достаточно близки.
В ядрах сперматозоидов человека и барана после удаления экстрагируемых белков, выявляются гранулярные белковые образования, от которых радиально отходят нити хроматина
(Evenaon, et al., 1978; Tsenev, Avramova, 1981). ЭТИ бвЛКО вые структуры устойчивые в концентрированных растворах хлористого натрия, в растворах мочевины, лизируются 2% до ДЄЦИЛСуЛЬфаТОМ натрия (Tsanev, Avramova, 1981). При 9ЛЄКТ рофорезе кислых белков спермы мышей в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, четко выражено преобладание полипептидов с молекулярной массой 76, 73 и 68 КД, наподобие описанным в ядерном матриксе соматических клеток (»Brient Beiive, 1980). Исследуемые белки являются, по-видимому, белковым скелетом ядер спермы.
Скелетные структуры хромосом
Из дегистонированных митотических или политенных хромосом изолирована группа негистоновых белков, образующая белковый остов ( scaffold ) прочно связанный с дезоксири бОНуКЛеИНОВОЙ КИСЛОТОЙ ( Adolph et al., 1977а,б; Adolph, 1980а,б; baemmli et al., 1977; Levis, Laemmli, 1982) .
Электронноникроскопические исследования препарата показали, что белковый остов хромосом или scaffiid представлен сплетением фибрилл, которые образуют структуру, сохраняющую форму интактной хромосомы. Эта структура или белковый остов играет существенную роль в организации высокоорганизованной компактной метафазной хромосомы, обеспечивая суперспиральное СОСТОЯНИе дезОКСИрибОНуКЛеОПрОТеИДа ( Adolph et ai.»1977а,б; Adolph, І980а,б; 1981; Laemmli et al., 1977; bewis.Laemmli, 1982).
Белковый остов хромосомы устойчив в концентрированных растворах хлористого натрия, в присутствии РНКазы и ДНКазы, но быстро дезинтегрирует при обработке проназой и мочевиной, наподобие белков ядерного матрикса интерфазной клетки. Электрофорез белков хромосомного остова в полиакриламидном геле, содержащем додецил сульфат натрия, выявляет около 30 полипептидных компонентов, среди которых выделяются полипептиды триплета. В составе белкового остова метафазной хромосомы описана группа металлопротеидов, стабилизированная двухвалентным катионом меди и имеющая, по-видимому, существенное значение в организации фибрилл хроматина (lewis, baemmii, 1982).
ДНК в метафазных хромосомах организована в петли, связанные С центральной ОСЬЮ ИЛИ беЛКОВЫМ ОСТОВОМ ( scaffold ) хромосомы ( Adoiph et ai., 1977а,б; Adoiph, 1980a,б, 1981; Paulson, Laemmli, 1977; laemmli et al., 1977; Kavenoff, Byder, 1976; Marsden, baemmli, 1979). ІЇЄТЛИ ДНК образуют ореол вокруг белкового остова, который можно наблюдать в не ЭКСТраГИрованных, НО раздутых хромосомах (Marsden, Laemmli, 1979; Adoiph, 19806) или в хромосомах дегистонированных декстран сульфатом и гепарином ( baemmii et ai., 1977). В присутствии этих реагентов вымывается 99$ гистонов и многие негистоновые белки, однако хромосомы сохраняются в виде высокоорганизованной, компактной структуры, которая обеспечивается белками остова или scaffold „ Концы петель ДНК, связанные с белковым остовом, расположены на близком расстоянии друг от друга, длина петли в среднем составляет 10-30 мкм, ЧТО соответствует 30-90 КИЛОбазам (Paulson, baemmli, 1977; Kavenoff, Ryder, 1976).
