Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 8
ВВЕДЕНИЕ 12
* 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
Эпидемия ВИЧ/СПИД 16
Вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) 17
Морфология и структура ВИЧ 17
Организация генома ВИЧ-1 19
Белки ВИЧ-1 21
1.3. Жизненный цикл ВИЧ-1 31
4 1.3.1. Взаимодействие ВИЧ с белками клетки-хозяина 31
1.3.2. Роль белка Gag в жизненном цикле ВИЧ-1 34
1.4. Экспрессия генов ВИЧ в процессе жизненного цикла 44
Ранняя и поздняя фазы экспрессии генов ВИЧ 44
Rev-система ВИЧ-1 47
Дестабилизирующие нуклеотидные последовательности, содержащиеся в мРНК ВИЧ-1 51
Влияние нуклеотидного состава генов на их экспрессию 55
Состояние проблемы создания вакцины против ВИЧ/СПИДа в
мире 59
1.8. Иммунологические аспекты ВИЧ-инфекции 63
1.8.1. Роль цитотоксических Т-лимфоцитов 64
1.8.2.Роль( С04+)-субпопуляции Т- лимфоцитов 66
1.8.3. Гуморальный ответ 68
* 1.8.4. Антителозависимая цитотоксичность 69
1.9. ДНК-вакцинация 72
1.10. Белок Gag как перспективный антиген в составе вакцины против
ВИЧ 83
Повышение эффективности ДНК-вакцинации путем оптимизации состава кодонов 85
Использование генов дефенсинов в составе ДНК-вакцин 86
* 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 92
2.1. Рекомбинантные плазмиды 92
Плазмида pGEM-T Easy 92
Плазмида рВМС 93
Плазмида pGmsf. 93
Плазмида pIRES-EYFP 93
Плазмида pET151/D-TOPO 94
Бактериальные штаммы 95
Эукариотические клеточные линии 95
Выделение и стимуляция перитонеальных макрофагов мыши 96
Выделение РНК из перитонеальных макрофагов мыши 97
Постановка реакции обратной транскрипции 97
Амплификация последовательности гена дефенсина-2р 98
Амплификация фрагментов ДНК гена gag 99
Быстрый скрининг рекомбинантных клонов методом ПНР 100
Очистка ДНК между ферментативными реакциями 101
Электрофорез в агарозном геле 101
Выделение плазмидной ДНК с помощью набора Wizard Plus Mini-Preps DNA Purification System (Promega, США) 102
Выделение плазмидной ДНК в градиенте хлористого цезия 102
Определение количества ДНК 103
Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы 103
Лигирование фрагментов ДНК 104
Рестрикция амплифицированных фрагментов ДНК и плазмид 104
Концентрирование нуклеиновых кислот 104
Метод введения нуклеотидных замен в нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Gag, с помощью ПНР 106
Синтез гуманизированной последовательности гена gag ВИЧ-1
субтипа А 107
Приготовление компетентных клеток для трансформации 108
Трансформация бактериальных клеток 109
Трансформация эукариотических клеток 109
Секвенирование клонированных фрагментов ДНК по методу Сенджера ПО
Методы анализа нуклеотидных последовательностей 113
Электрофорез белков в денатурирующих условиях по Леммле 113
Электрофоретический перенос белков лизата клеток линии 293Т
с последующим ИФА 114
Выделение спленоцитов мышей 115
Окрашивание поверхностных антигенов 115
Окрашивание внутриклеточных цитокинов 116
Анализ на проточном цитофлуориметре 117
Иммуноферментный анализ 117
Модификация метода ИФА для анализа титра антител к
* рекомбинантному белку р24 119
Пептид, используемый для анализа цитотоксической активности лимфоцитов 119
Цитотоксический анализ 120
Условия культивирования BL21 Star и индукции экспрессии белка
р24 121
2.37. Электрофоретический перенос белков клеточного лизата Е. coli с
^ последующим ИФА 121
Построение калибровочной кривой для количественного определения концентрации белка р24 122
Лабораторные животные 123
Приготовление лизата клеток E.coli BL21 Star, содержащих белок
р24 123
Схема иммунизации лабораторных животных 124
Статистический анализ полученных результатов 124
2.43. Компьютерные методы анализа данных 125
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 126
3.1. Создание эукариотических экспрессионных плазмид 126
Клонирование полноразмерной последовательности гена gag в плазмиде pGEM-T Easy 126
Секвенирование клонов, содержащих полноразмерную
^ последовательность гена gag ВИЧ-1 субтипа А 128
Компьютерная обработка результатов секвенирования 130
Создание экспрессионной конструкции на основе вектора рВМС, содержащего последовательность гена gag ВИЧ-1 субтипа А... 131
Результат секвенирования клонов, содержащих полноразмерную последовательность гена gag ВИЧ-1 субтипа А 133
3.1.6. Расчет синтетической последовательности гена gag 135
^ 3.1.7. Дизайн праймеров для внесения нуклеотидных замен 137
3.1.8. Результат секвенирования полученной синтетической
нуклеотидной последовательности , кодирующей белок р55 139
3.1.9. Сравнение полученной синтетической последовательности
gagSynt с нативной последовательностью, кодирующей белок Gag 140
3.1.10. Клонирование синтетической нуклеотидной
последовательности, кодирующей белок Gag, в экпрессионный
вектор рВМС 141
3.1.11. Дизайн и синтез гуманизированной последовательности гена
gag 142
Синтез кДНК дефенсина-2р мыши 145
Создание экспрессионной плазмиды, содержащей кДНК дефенсина-2р мыши 147
3.2. Анализ экспрессии дефенсина-2р , нативного, синтетического и
гуманизированного генов gag 150
Экспрессия дефенсина-2р в клетках линии 293Т 150
Сравнение уровня экспрессии белка Gag в культурах клеток 293Т, трансформированных плазмидами pBMCgagA и pBMCgagSynt,
с помощью метода иммуноблотта 152
Сравнение уровня экспрессии белка Gag в клетках 293Т, трансформированных плазмидами pBMCgagA, pBMCgagSynt и pBMCgagHum 154
Иммуноферментный анализ культуральной среды клеток 293Т, трансформированных плазмидными ДНК, экспрессирующими различные модификации гена gag 155
Концентрация антигена р24 в сыворотке мышей после иммунизации плазмидными ДНК, экспрессирующими нативный и гуманизированный гены gag ВИЧ-1 субтипа А 156
3.3. Экспрессия рекомбинантного белка р24 157
Клонирование нуклеотидной последовательности белка р24 в прокариотической экспрессионной плазмиде рЕТ151 157
Экспрессия рекомбинантного белка р24 в бактериальных клетках 160
3.4. Анализ иммуногенных свойств созданных рекомбинантных ДНК 163
3.4.1. Уровень гуморального иммунного ответа, возникающего у
мышей после иммунизации плазмидными ДНК, экспрессирующими
нативный и гуманизированный гены gag ВИЧ-1 субтипа А 163
Уровень гуморального иммуного ответа, возникающего у мышей после иммунизации плазмидой pBMCgagA или после совместной иммунизации плазмидами pBMCgagA и pBMCdef 164
Цитотоксический иммунный ответ, возникающий при
* иммунизации плазмидными ДНК, экспрессирующими нативный и
гуманизированный гены gag ВИЧ-1 субтипа А 165
Цитотоксический иммунный ответ, возникающий при иммунизации препаратом, экспрессирующими нативный ген gag ВИЧ-1 субтипа А и дефенсин-2Р 167
Уровень INF-y, продуцируемый С08+-лимфоцитами мышей после иммунизации ДНК-иммуногенами, имеющими различный
^ уровень экспрессии гена gag 168
3.4.6. Уровень INF-y, продуцируемый CD8+ лимфоцитами мышей
после иммунизации ДНК-иммуногенами, экспрессирующими ген
gag и дефенсин-2(3 170
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 172
4.1. Влияние нуклеотидного состава гена gag на его экспрессию в
клетках млекопитающих 172
Экстраклеточная локализация белка Gag в зависимости от уровня экспрессии гена gag в эукариотических клетках in vitro и in vivo 176
Экспрессия рекомбинантного белка р24 в клетках E.coli 178
Гуморальный ответ, возникающий после иммунизации плазмидными ДНК, экспрессирующими различные модификации
гена gag 180
4.5. Цитотоксичекий ответ, возникающий после иммунизации
t плазмидными ДНК, экспрессирующими различные модификации
гена gag 181
Изменение уровня INF-y, продуцируемого С08+-лимфоцитами мышей после иммунизации ДНК-иммуногенами 183
Динамика цитотоксического и гуморального ответа 183
Использование иммуномодулятора pBMCdef совместно с ДНК-иммуногеном на основе гена gag 188
ц 4.9. Перспективность использования созданных плазмид в составе
кандидатной ДНК-вакцины против ВИЧ-1 191
ВЫВОДЫ 193
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 195
%
*
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 237
ПРИЛОЖЕНИЕ II 238
ПРИЛОЖЕНИЕ III 242
ПРИЛОЖЕНИЕ IV 243
БЛАГОДАРНОСТИ 244
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИИ
APOBEC3G
АТР AUBPs
AUF1 AURE
DMEM
E.coli
EMEM
FITC
Go G2 GM-CSF
GTP HCV
Apolipoprotein В mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-
like-3G (фермент, редактирующий мРНК аполипопротеина В)
Adenosine Tri-phosphate (аденозинтрифосфат)
AURE-binding proteins (семейство белков, связывающихся с
AURE)
AU-Factor 1 (белок семейства AUBP)
AU-Rich Element (элемент последовательности мРНК, богатый
аденином и урацилом)
Противотуберкулезная вакцина Кальметта-Герена
Base pare (пара нуклеотидов)
CG-мотивы
Claster of differentiation (кластер дифференцировки)
Cis-active Repressor Sequences (цис-активные репрессирующие
последовательности на последовательности мРНК) .
Constitutive Transport Element (конститутивный транспортный
элемент на мРНК некоторых онкоретровирусов)
Cytotoxic T-lymphocytes (цитотоксические Т-лимфоциты)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Escherichia coli
Eagle Minimum Essential Medium
Ruoresceinisotiocyanat (флуоресцеинизотиоцианат, длина волны
испускания 520 нм)
Митотическая фаза покоя
Постсинтетическая фаза митоза
Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (гранулоцитарно-
макрофагальный колониестимулирующий фактор)
Guanine tri-phosphate (гуанинтрифосфат)
Hepatitis С Virus (вирус гепатита С)
HERV Human endogenous retrovirus (человеческий эндогенный вирус)
HLA Human leukocyte antigen (лейкоцитарный антиген человека)
HTLV-ІДІ Human T-cell leukemia virus-1,11 (Вирус Т-клеточной лейкемии
человека)
IL Интерлейкин
INF Интерферон
INS Instability Sequence (дестабилизирующая последовательность
на мРНК)
IPTG Изопропил-Р-тио-галактопиранозид
IQ Константа диссоциации
LB-arap Агар Луриа-Бертани
LB-среда Среда Луриа-Бертани
LTR Long Terminal Repeate (длинный концевой повтор)
mac Масаса mulata (макака темная)
MHCI Молекула главного комплекса гистосовместимости 1 класса
МНСП Молекула главного комплекса гистосовместимости 2 класса
NK Normal Killers (нормальные киллеры)
NLS Nuclear Localization Signal (сигнал ядерной локализации)
NP-40 детергент
PABPI PolyA Binding Protein (белок, связывающий полиадениновые
последовательности)
PBS Натрийфосфатный буфер
(150MMNaCl;20MMNa2HPO4/NaH2PO4,pH7,6)
РЕ Phycoeritrine (фикоэритрин, длина волны испускания 575 нм)
RBD RRE Binding Domain (домен RRE)
RRE Rev Responsible Element (элемент, связывающийся с белком Rev)
SDS Додецилсульфат натрия
SIV Simian Immunodeficiency Virus
(вирус иммунодефицита обезьян)
TAR Trans-activating response element
TAE 40 мМ Трис-ацетат, 2мМ ЭДТА, рН 8,0 (буфер)
ТВЕ 89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА рН 8,0
(буфер)
ТЕ ЮмМ Трис-HCl рН 8,0, 1мМ ЭДТА (буфер)
Th T-lymphocyte helper (лимфоцит-помощник)
TNF Tumor Necrosis Factor (фактор некроза опухоли)
TsglOl Tumor susceptibility gene 101
Синтеза Температура синтеза
X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Б-галактопиранозид
АЗКЦТ Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность
АПК Антиген-презентирующие клетки
ВИЧ-1 Вирус иммунодефицита человека первого типа
ВИЧ-2 Вирус иммунодефицита человека второго типа
Да Дальтон
дАМФ Дезоксиаденин трифосфат
ДК Дендритные клетки
ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ Дезоксинуклеозидтрифосфаты
дТМФ Дезокситимидин трифосфат
ДТТ Дитиотретол
ИФА Иммуноферментный анализ
кб Килобаза
мРНК Матричная РНК
Н2Ь Генотип системы антигенов гистосовместимости у мышей
нДК Незрелые дендритные клетки
ОП Оптическая плотность
ОП6оо Оптическая плотность на длине волны 600 нм
п.н. Пара нуклеотидов
ПААГ Полиакриламидный гель
ПЦР Полимеразная цепная реакция
РНК Рибонуклеиновая кислота
РНКаза Рибонуклеаза
СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита
Т отж. Температура отжига
т.п.н. Тысячи пар нуклеотидов
ТМБ Тетраметилбензидин
Трис Трис( гидроксиметил) аминометан
тРНК Транспортная РНК
TPHKLys Транспортная РНК лизина
ФСБ-твин Фосфатно-солевой буфер с твин-20 (О, 01М Na2HP04/NaH2P04
рН 7.20, 0.15 М NaCl, 0,3% твин-20)
ЭДТА Этилендиаминтетраацетат динатриевая соль
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
Введение к работе
Ген gag вируса иммунодефицита человека первого типа кодирует структурные компоненты оболочки вируса. Известно, что Gag является
* одним из относительно консервативных белков лентивирусов, поэтому
считается, что иммунный ответ на Gag может быть действенным против различных субтипов ВИЧ-1. При изучении иммунного ответа ВИЧ-1 инфицированных пациентов было показано, что высокое содержание Gag-специфических С08+Т-лимфоцитов коррелирует с низкой вирусной нагрузкой. Антитела к некоторым участкам белка Gag также снижают
+ вирусную нагрузку и вызывают нейтрализацию вируса.
Следовательно, можно полагать, что развитие клеточного и гуморального иммунитета на эпитопы gag при ДНК-вакцинации организма может иметь протективный эффект. Однако, создание ДНК-вакцины на основе последовательности gag представляет собой сложную задачу. Было показано, что экспрессия гена gag в эукариотических клетках жестко
~ регулируется другим вирусным белком - Rev, регуляция экспрессии
которого представляет собой сложный процесс. Таким образом, для создания ДНК-вакцины на основе последовательностей gag необходимо регуляцию экспрессии гена gag сделать независимой от белка Rev. В генах ВИЧ-1 используются кодоны, редко встречающиеся в генах человека, следовательно, при конструировании ДНК-вакцины для оптимизации экспрессии целевого белка необходимо произвести частичную замену кодонов.
Было показано, что эффективность ДНК-иммунизации значительно возрастает при использовании в составе вакцины генов, кодирующих различные хемокины и дефенсины, стимулирующие CD8+ Т-лимфоциты и дендритные клетки. Дефенсин-2р также является сильным хемоаттрактантом для дендритных клеток, стимулирующим их созревание.
Цель и задачи исследования
Исходя из вышеизложенного, целью нашей работы является оптимизация нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Gag ВИЧ-1 субтипа А для увеличения его экспрессии in vivo и создание ДНК-иммуногена против ВИЧ на основе оптимизированного гена с дополнительным использованием гена, кодирующего дефенсин-2р. Задачи исследования:
1 .Оптимизировать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Gag ВИЧ-1 субтипа А.
Изучить экспрессию различных вариантов оптимизированного гена gag в клетках млекопитающих in vivo и in vitro.
Изучить иммунный ответ, вызываемый при иммунизации лабораторных животных плазмидными ДНК, экспрессирующими различные варианты модифицированного гена gag.
Изучить иммунный ответ, вызываемый при иммунизации лабораторных животных плазмидной ДНК, кодирующей целевой антиген Gag и плазмидной ДНК, кодирующей пептидный иммуномодулятор дефенсин-2р.
Научная новизна работы
Впервые установлена зависимость между нуклеотидным составом и уровнем
экспрессии гена gag ВИЧ-1 российского варианта субтипа А. Оценена роль
дестабилизирующих участков нуклеотидной последовательности гена gag и
состава кодонов в эффективности трансляции белка Gag.
Впервые изучена динамика образования антигена Gag in vivo после введения
ДНК-иммуногена.
Впервые показано отличие в формировании клеточного и гуморального
иммунных ответов в зависимости от интенсивности экспрессии
внутриклеточного иммуногена.
Исследовано влияние белкового иммуномодулятора дефенсина-2р, кодируемого плазмидной ДНК, на развитие иммунного ответа при совместном введении с ДНК-иммуногеном на основе гена gag.
Научно-практическое значение работы
Данные проведенного исследования представляют собой часть большой
работы, проводимой в Биомедицинском центре и лаборатории
молекулярной вирусологии Гос НИИ Особо Чистых Биопрепаратов, по созданию вакцин против ВИЧ. Один из подходов к созданию вакцины
«і основан на иммунизации организма плазмидной ДНК, экспрессирующей
гены ВИЧ-1. В связи с этим большое значение имеет изучение механизмов и факторов, влияющих на экспрессию гетерологичных генов в клетках млекопитающих. Зависимость уровня экспрессии гена от его нуклеотидного состава делает возможным использование искусственных генов с целью повышения их экспрессии. Сконструированные химерные гены могут быть
* использованы в практических целях для модуляции уровня экспрессии
трансгенов. В процессе модулирования экспрессии иммуногенов, кодируемых ДНК-вакциной, получены данные о влиянии уровня экспрессии антигена на формирование иммунного ответа, которые позволяют создавать ДНК-иммуногены с различными иммуногенными свойствами. Созданная в ходе настоящей работы плазмида pBMCdef2b, экспрессирующая дефенсин- 2р\ может быть использована как адьювант к различным ДНК-вакцинам для модуляции и усиления их иммуногенных свойств. Полученая в ходе представленной работы нуклеотидная последовательность gagHum входит в состав ДНК-вакцины против ВИЧ, а также в состав вакцины на основе аттенуированных клеток сальмонеллы. Препараты успешно прошли фазу доклинических испытаний, которые позволяют отнести их к V классу практически безопасных лекарственных веществ. В дальнейшем планируются клинические испытания созданных иммуногенов.
Форма выполнения диссертационной работы
Работа выполнялась в рамках финансирования Негосударственного Научно-исследовательского Учреждения "Биомедицинский центр" и ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" по проекту Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" и научно-техническому проекту МНТЦ №2344.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 9-Й-15-Й Международных конференциях "СПИД, рак и общественное здоровье", Санкт-Петербург, Россия, 1999-2006; Барселона, Испания, 2002; конференциях "Вакцина против СПИДа", Филадельфия, США, 2001 и Нью-Йорк, США, 2003; 10-й конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, Бостон, США, 2003; 2-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Париж, Франция, 2003. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 3 патента и 13 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, иллюстрирована 63 рисунками, 21 таблицой и 4 приложениями. Список литературы содержит 349 литературных источников.
