Создание химиотерапевтических противоопухолевых систем направленного действия с использованием белковых факторов Луценко, Сергей Викторович

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Одной из важнейших задач современного естествознания является поиск путей и возможностей проведения регуляторных сигналов для осуществления целенаправленного воздействия на физиологические процессы, протекающие в живой клетке. В качестве таких путей нами рассматривалась система мессенджеров, реализующая каскадное усиление внешнего сигнала и рецепторопосредованный эндоцитоз - механизм селективного концентрирования и поглощения специфических лигандов. Посредством согласованного действия систем мессенджеров реализуется регуляция ключевых внутриклеточных процессов. При взаимодействии первичных мессенджеров с соответствующими рецепторами, под действием сопряженных с рецептором ферментативных систем, внутриклеточный уровень вторичных мессенджеров изменяется, что приводит к запуску регуляторных ферментных каскадов, основными звеньями которых являются ферменты, модифицирующие соответствующие субстраты, что в конечном итоге приводит к определенным физиологическим реакциям. Одним из ключевых ферментов, играющих важную роль в передаче трансмембранного сигнала, но до настоящего времени недостаточно изученным, является Са³7кальмодулинзависимая протеинкиназа П (ПКІІ), опосредующая регуляторное действие Са²⁺ на внутриклеточные процессы. Основным физиологическим субстратом ПКП является синапсин I - белок, ассоциированый с цитоплазматической поверхностью синаптичсских везикул нервных окончаний, участвующий в процессах нейросекреции и возникновении ряда заболеваний нервной системы. Изучение свойств и роли ПКП в процессах клеточной пролиферации, секреции нейротрансмиттеров, функционировании цигоскелета, гликолизе, опухолевом росте и патологических нарушениях нервной системы представляется актуальным. Разъяснение значения фосфорилирования синапсина I и взаимодействия белка с элементами цитоскелета создает основу для более детального понимания механизма нейросекреции. Исследование физиологической роли ПКП и ее субстратов позволяет не только определить место данного фермента в системе регуляции клеточной активности, но и расширить представления о возможности избирательной регуляции внутриклеточных процессов на уровне вторичных мессенджеров и на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

Помимо системы мессенджеров, перспективным путем избирательного воздействия на внутриклеточные процессы является рецепторопосредованный эндоцитоз - общий механизм переноса в клетки эукариот биологически активных веществ. С использованием эндоцитоза может быть осуществлен избирательный транспорт в клетку-мишень химически связанных с физиологическими лигандами различных модуляторов клеточной активности, в том числе и лекарственных препаратов. Избирательность транспорта при этом достигается за счет способности лигаяда (вектора) к высокоаффинному связыванию со специфическими рецепторами, экспрессированными только/или преимущественно на клетках-мишенях. Для практического применения векторы должны отвечать ряду требований, к числу

которых относятся: доступность в препаративных количествах, стабильность, сохранение высокого сродства к рецептору после химической модификации. В полной мере этим требованиям отвечают эпидермальный фактор роста (ЭФР), аномально высокий уровень экспрессии рецепторов которого отмечается в клетках опухолей эпителиального происхождения, и онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецепторы которого экспрессируются практически всеми типами раковых клеток, но отсутствуют на клетках нормальных тканей. Поэтому ЭФР и АФП были использованы нами для создания систем направленного действия, предполагающих наличие специфического рецептора и ковалентно связанных векторного белка и модулятора клеточной активности. Подобные системы могут найти применение в различных областях медицины для изучения возможностей направленного влияния на физиологические процессы и повышения эффективности действия известных химиотерапевтических средств при лечении целого ряда заболеваний, включая онкологические. В настоящее время фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов. Применение систем направленного транспорта с использованием моноклональных антител в качестве векторов не оправдало надежд на их высокую терапевтическую активность. Создание противоопухолевых систем направленного действия с использованием физиологических векторов (АФП и ЭФР) для избирательного транспорта широко применяемых в клинической практике химиопрепаратов — порфиринов, антрациклшговых антибиотиков и растительных алкалоидов - в опухолевые клетки призвано послужить решению задачи повышения терапевтически! эффективности химиопрепаратов за счет снижения токсичности и увеличения избирательности их действия. Сравнительное исследование в модельных экспериментах in vitro и in vivo уровня противоопухолевой активности полученных систем направленного действия позволяет оценить возможности их применения в области практической онкологии. Изучение динамики накопления и внутриклеточного распределения химиопрепаратов, доставляемых в клетку в составе систем направленного действия, имеет существенное теоретическое и прикладное значение, поскольку позволяет прояснить механизм их цитотоксического действия и наметить пути повышения его эффективности.

В настоящее время масштабное исследование биологических функций и возможностей применения в медицине целого ряда белков, особенно факторов роста и цитокинов, ограничено из-за их труднодоступности в препаративных количествах из природных источников. В связи с этим представляется безусловно актуальной задача разработки с использованием генно-инженерных подходов методов экспрессии, получения и характеристики биологически активных рекомбинантных белков, в частности ЭФР и интерлейкинов 3 и 4, обладающих значительным потенциалом для использования в различных областях медицины.

Целью диссертационного исследования явилось исследование путей проведения клеточных регуляторных сигналов (системы Са²⁺, реализующей каскадное усиление внешнего сигнала посредством активации ПКП, модифицирующей синапсин I, и системы рецепторопосредованного зндоцигоза — механизма селективного концентрирования и поглощения специфических лигандов) на предмет определения возможностей избирательного влияния на физиологические процессы, протекающие в клетке; создание эффективных терапевтических систем направленного действия и оценка перспективности их последующего клинического использования; получение с использованием генно-инженерных подходов препаративных количеств векторных белков - потенциальных компонентов систем направленного действия.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и выполнены следующие основные задачи:

1. Выделить ПКП и синапсин I и исследовать физико-химические свойства белков, субстратную специфичность ПКП, а также регуляторное влияние автофосфорилирования, фосфолипидов и жирных кислот на активность фермента.

2. Исследовать регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза.

3. Провести сравнительное исследование кальмодулинсвязывающих центров ПКП и других кальмодулинзависимых ферментов, направленное на выявление гомологичных участков.

4. Определить возможности взаимодействия синапсина I с элементами цитоскелета и регуляторного влияния фосфорилирования на этот процесс.

5. Обобщить полученные данные и определить роль фосфорилирования синапсина I в регуляции неиросекреции и возможности направленного контроля за избирательностью прохождения регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами.

6. Осуществить синтез эффективных систем направленного действия (СНД), включающих противоопухолевые химиопрепараты (фталоциакины, хлорины, антрациклиновые антибиотики и растительные алкалоиды) и векторные белки (чЭФР, рецепторсвязывающий фрагмент чЭФР (чЭФРФР) и чАФП). Исследовать свойства, динамику поступления, внутриклеточного распределения и возможности терапевтического применения полученных СНД.

7. Изучить возможности снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам при использовании СНД.

8. Создать генно-инженерные штаммы-продуценты белков человека (чЭФР, чИЛ-3 и чИЛ-4) и разработать эффективные методы выделения и ренатурации, позволяющие получать рекомбинантные белки в препаративных количествах для использования в качестве компонентов СНД и применения в области медицины.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов заключается в фундаментальном значении теоретических выводов, следующих из диссертации.

Значительно дополнены имеющиеся сведения о физико-химические свойствах ПКП и ее субстрата синалсина I, субстратной специфичности ПКП, регуляторном влиянии автофосфорилирования на активность фермента.

Впервые исследовано регуляторное действие продуктов липидного обмена в отношении ПКП. Показано игибнрующее действие фосфолипидов и жирных кислот на активность ПКП и активацию фермента кальмодулином.

Впервые обнаружено наличие в структуре кальмодулинзависимых ферментов (ПКП, киназы фосфорилазы и фосфодиэстеразы сАМР) и синапсина I гомологичных кальмодулинсвязывающих участков, что отражает структурно-функциональную консервативность кальмодулинзависимых регуляторных механизмов.

Впервые продемонстрировано регуляторное влияние ПКП на процесс гликолиза, посредством активации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД).

Обнаружена способность белка цитоскелета тубулина к связыванию с синапсином I - основным белком внешней поверхности синаптических везикул. Впервые показано значительное снижение аффинности взаимодействия синапсина с тубулином при фосфорилировании синапсина I протеинкиназами.

Исходя из полученных данных сформулирована гипотеза о ключевой роли фосфорилирования синапсина І в регуляции нейросекреции, наглядно иллюстрирующая чрезвычайную сложность избирательного проведения однонаправленного регуляторного сигнала на стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами. Предложен гипотетический механизм нейросекреции, основанный на регуляторной роли фосфорилирования синапсина I различными протеинкиназами.

Впервые показана возможность использования рецепторсвязывающего фрагмента чЭФР (чЭФРФР) в качестве вектора для создания высокоэффективной системы направленного транспорта ДР в опухолевые клетки.

Разработаны оптимальные схемы получения эффективных противоопухолевых СНД, включающих фталоцианины, хлорины, антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и векторные белки (чЭФР, чЭФРФР (в случае ДР) и чАФП). Противоопухолевая активность полученных систем значительно превышает активность соответствующих свободных химиопрепаратов.

Продемонстрирована возможность значительного снижения лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антрациклиновым антибиотикам при использовании систем направленного действия.

Впервые исследована динамика накопления и внутриклеточное распределение антрациклинов, доставляемых в опухолевые клетки в составе СНД с использованием ЭФР в качестве белкового вектора. Полученные данные проливают свет на механизм цитотоксического действия СНД и позволяют наметить пути увеличения их противоопухолевой активности.

Установлено, что при поступлении антрациклинов в клетки MCF-7^wt и MCF-7^AdrR в составе СНД, уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

На основе сконструированных плазмид Е. coli, позволяющих осуществить эффективную экспрессию синтетических генов ЭФР, ИЛ-3 и ИЛ-4 человека в условиях конститутивного и индуцированного биосинтеза белка, получены штаммы-продуценты Е. coli.

Разработаны простые и эффективные методы выделения и ренатурации рекомбинантных чЭФР, чНЛ-3, чИЛ-4, позволяющие получать биологически активные белки.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:

Разработанные эффективные методы получения чрезвычайно лабильного фермента ГПШ и синапсина I, позволяющие значительно сократить время выделения и увеличить выход целевых белков, могут найти применение при проведении фундаментальных исследований в области энзиматической регуляции клеточной активности.

Разработанные противоопухолевые СНД на основе химиопрепаратов различных классов и физиологических белковых векторов, наряду с оптимизированными методами их получения и тестирования, могут быть использованы для дальнейших исследований в области практической онкологии.

Применение рецепторсвязывающего фрагмента ЭФР в качестве молекулярного вектора позволяет, наряду с увеличением стабильности и эффективности действия, достичь значительного снижения стоимости СНД.

Использованные при конструировании плазмид подходы, позволяющие осуществлять эффективную экспрессию синтетических генов чЭФР, чИЛ-3 и чИЛ-4, могут применяться в области генетической инженерии и биотехнологии для получения штаммов - продуцентов различных рекомбинантных белков.

Полученные штаммы - продуценты Е. coli чЭФР, чИЛ-3 и чИЛ-4 и разработанные методы очистки и ренатурации рекомбинантных белков могу быть использованы в области промышленной биотехнологии, а полученные рекомбинантные белки как для научно-исследовательских работ, так и в области практической медицины.

В процессе разработки практических основ технологии получения рекомбинантных белков на основе генно-инженерных подходов оформлен патент на изобретение.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований доложены на симпозиуме "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций", Рязань, 1985; симпозиуме "Химия и биохимия пептидно-белковых гормонов", Суздаль, 1985; симпозиуме "Фундаментальные достижения нейрохимии -медицине", Горький, 1987; симпозиуме по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; VII симпозиуме "Химия белков и пептидов", Таллин, 1987; VI симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных

реакций", Петрозаводск, 1988; V советско-швейцарском симпозиуме «Биологические мембраны: структура и функции», Рига, 1988; Bayev memorial conference, Cobiotec-RAN, Moscow, Russia, 1996; The XXTV Meeting of the ISOBM, San Diego, Calif. USA, 1996; втором съезде биохимического общества РАН, Москва, Пушино, 1997; The XXV^th Anniversary Meeting of the ISOBM, Montreux. Switzerland, 1997; International Conferences New Anticancer Agents, Athens, Greece, 1997; VIII конференции «Новые направления биотехнологии» РАН, Москва, 1997; The XXVI Meeting of ISOBM, Umea, Sweden, 1998; lO^NCA-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, Netherlandes, 1998; 15^ш meeting European association for cancer research, Stockholm, Sweden, 1998; Fourth European congress of pharmaceutical sciences, Milan, Italy, 1998; VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1999; 27^th Meeting of the ISOBM, Kyoto, Japan, 1999; II съезде биофизиков России, Москва, 1999; The 17* Meeting of the International Academy of Tumour Marker Oncology, Hong Kong, 2000.

Структура и объем диссертации. Структура диссертации традиционна. Она содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, общие выводы и указатель цитируемой литературы.

Основные положения, выносимые на защиту.

9. ПКП - ключевой фермент со сложной системой регуляции активности, опосредующий регуляторное действие Са²⁺ в отношении процессов нейросекреции и гликолиза.

10. Ряд кальмодулинзависимых ферментов и синапсин I, содержат в своей структуре консервативные иммунологически подобные кальмодулинсвязывающие последовательности.

11. Избирательная регуляция внутриклеточных процессов на уровне вторичных мессенджеров и стадии химической модификации субстрата активированными ферментными системами является трудноосуществимой из-за тесной взаимосвязи и сложной организации взаиморегуляции как системы вторичных мессенджеров, так и фермент-субстратных систем.

12. Противоопухолевые системы направленного транспорта фталоцианинов, хлоринов, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов, полученные путем химического синтеза с использованием чЭФР и чАФП в качестве векторных молекул, позволяют снизить клеточную резистентность и проявляют противоопухолевую активность, значительно превышающую активность свободных химиопрепаратов.

13. Рецепторопосредованный эндоцитоз является механизмом, позволяющим осуществлять модулирование клеточной активности или селективное элиминирование клеток-мишеней при использовании систем направленного действия.

14. Сконструированные генно-инженерным путем плазмиды, несущие синтетические гены чЭФР, чИЛ-З и ИЛ-4 позволяют осуществлять эффективную экспрессию

целевых белков в клетках штаммов-продуцентов. Разработанные методы очистки и ренатурации позволяют получать в препаративных количествах биологически активные рекомбинантные белки человека.